一種特異于禽類原始生殖細胞的基因轉移系統及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物基因工程領域，涉及建立一種特異于禽類原始生殖細胞的基因轉 移系統以及基于此基因轉移系統介導的禽類轉基因方法。
【背景技術】
[0002] 轉座子是一類在基因組上可以自由跳躍(復制或移位）的DNA序列，由Mc.Clintock 于1940年首先在玉米中發現，以后又陸續在細菌、真菌及昆蟲等各種生物中發現。近年來， 轉座子系統已經應用于非病毒介導的轉基因，尤其是轉基因哺乳動物方面。但在轉基因禽 類制備方面，基于禽類特殊的生理生殖特點，即：胚胎的早期發育在母禽的生殖系統就已啟 動，因而即使是剛產出的蛋，也已發育成具有約60000個形態上未分化的全能細胞的胚盤 (位于囊胚腔），以及禽類受精卵和早期胚胎具有碩大的卵黃、難以直接進行基因操作等原 因，禽類轉基因技術一直落后于其它動物。
[0003] 轉基因禽類制備具有繁殖周期短、生產性能高、研究成本較低等優點，其輸卵管是 生產蛋白質的天然"發酵罐"。近年來禽蛋生物反應器以其自身的優勢和不可限量的前景漸 漸成為一個新的研究熱點。其中，轉基因雞制備主要集中于病毒侵染X期胚盤、體外或體內 轉染PGCs等方法。這些方法雖然取得了一定成果，但仍然存在轉基因效率不高、基因表達抑 制和基因沉默現象以及生物安全性等問題，所以轉基因禽類的制備一直以來都缺少一種有 效的、非病毒介導的基因轉化系統。轉座子介導技術的使用，提高了外源基因在雞基因組的 整合效率，展示了制備轉基因禽類的前景。常用的轉座子系統有鮭魚SB( Sleeping beauty)、PB(PiggyBac)、Tol2等，都是根據"切割-黏貼"的方式進行轉座，可以有效地提高 轉基因動物制備效率，但轉座子系統不具有生殖細胞特異性，其在體細胞和生殖細胞中基 因轉移率相當，所以轉基因后代仍存在嵌合體多、性腺基因轉移效率低下等問題。
[0004] 原始生殖細胞(PGCs)是精子和卵子的前體細胞，在PGCs生殖質中含有線粒體16S rRNA和Vasa、0ska、Tudor基因蛋白。Vasa是生殖發育調控重要的基因之一，在胚胎發育過程 中只在性腺組織中表達，具有組織特異性。Vasa的同源物也在包括雞在內的很多物種中證 實：Naoki Tsunekawa等（Naoki Tsunekawa,Mitsuru Naito,Yasuhiro Sakai ,Takao Nishida and Toshiaki Noce,Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells.Development,2000,127:2741-2750)發現了生殖 系特異表達的雞的vasa同源基因 CVH(chicken vasa homologue)蛋白貫徹整個雞胚發育期 及成年睪丸和卵巢中，表明了CVH與雞胚生殖系的發育相關；同時Minematsu等（ΤΑΚΕ0 MINEMATSU,TAKASHI HARUMI,AND MITSURU NAITO,Germ Cell-Specific Expression of GFP Gene Induced by Chicken vasa Homologue(Cvh)Promoter in Early Chicken Embryos.MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT,2008,75:1515-1522)也通過直接將 不同長度CVH啟動子體內、體外轉染雞胚生殖細胞的實驗，驗證了該vasa同源基因 CVH的生 殖細胞特異性，且得出了 "增強基因表達需要CVH基因5'側翼區序列長度至少為1555bp"的 結論。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種特異性強、基因轉移效率高的特異于禽類原始生殖細 胞(PGCs)的基因轉移系統及方法。本發明的發明理念是:構建特異于禽類PGCs的基因轉移 系統，該基因轉移系統的轉座酶輔助質粒含有vasa啟動子，由vasa啟動子驅動轉座酶，利用 vasa啟動子能夠在PGCs中特異表達的特性，實現轉座酶在PGCs中的特異性表達，從而使得 該基因轉移系統的轉座子供體質粒所攜帶的目的基因表達盒在PGCs特異性切割整合，由此 提高轉座子介導目的基因（如：報告基因或者外源基因等）在PGCs的基因轉移特異性和效 率;此外，可以在該基因轉移系統的啟動子前增加通用增強子元件（即無組織特異性的增強 子元件，如SV40 )，進一步驅動轉座酶在PGCs中高效特異表達；轉染禽類早期胚胎血液中 PGCs細胞，實現外源基因在禽類胚胎PGCs基因組中高效特異整合，從而提高轉基因禽的制 備效率，推動轉基因禽研究進展。
[0006] 為了達到上述目的，本發明的技術方案如下：
[0007] 本發明提供了一種特異于禽類原始生殖細胞的基因轉移系統，其特征在于，包括 轉座子系統，所述轉座子系統包括轉座子供體質粒和轉座酶輔助質粒，其中，所述轉座酶輔 助質粒含有具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的vasa啟動子。
[0008] 為了達到更高的基因轉移效率，所述轉座酶輔助質粒還含有通用增強子元件（即 無組織特異性的增強子元件）；優選地，所述通用增強子元件為具有如SEQ ID No.2核苷酸 序列所示的SV40增強子元件。
[0009] 所述轉座子系統可以為SB轉座子系統，也可以是PB、Tol2和ZB等常用轉座子系統。 [0010]所述轉座子供體質粒可以是PT3-PST，包括ro、SB、Tol2轉座子兩側末端重復序列 和Mscl克隆位點，克隆位點可插入需要轉移的目的基因表達盒。
[0011] 所述目的基因盒可以是報告基因表達盒，或者其它外源基因表達盒。
[0012] 優選地，所述轉座子系統為SB轉座子系統時，轉座酶質粒包括SB100X轉座酶cDNA 序列。
[0013] 優選地，在轉染上述特異于禽類原始生殖細胞的基因轉移系統時，使用可調節氣 體壓力的玻璃毛細管細針進行顯微注射。該方法操作簡單快捷、效率高、實驗重復性好。相 比之下，禽胚注射通常采用口吸管注射法或顯微操作儀，這兩者對操作者技術水平要求較 高。口吸管法顯微注射劑量受人為因素影響較大，導致實驗重復性較差;顯微操作儀價格昂 貴，操作難度較大。
[0014] 本發明還提供了一種特異于禽類原始生殖細胞的基因轉移方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0015] (1)使用生物工程方法，構建如上所述的含有vasa啟動子或者含有vasa啟動子和 通用增強子元件的轉座酶輔助質粒；
[0016] (2)使用生物工程方法，構建含有需要轉移的目的基因表達盒的轉座子供體質粒；
[0017] ⑶提取質粒后，將步驟⑵中所得的轉座子供體質粒和步驟⑴中所得的轉座酶 質粒按1:2比例混合均勻，調整其終濃度為500ng-1.5ygAiL;
[0018] (4)將步驟(3)中所得的混合質粒使用包埋劑包裹后，轉染禽類早期胚胎血液中 PGCs細胞，從而使得轉座酶僅在PGCs細胞特異表達，提高嵌合體禽類生殖系轉基因效率。
[0019] 優選地，步驟(4)中所述的包埋劑為多聚乙烯亞胺(PEI)。
[0020] 本發明所達到的技術效果是：
[0021 ] 1)本發明構建了具有PGCs特異表達特性的基因轉移系統，該系統包括含有vasa啟 動子的轉座子系統，vasa啟動子是生殖細胞特異啟動子，能夠指導下游基因在生殖細胞特 異的表達;此外，在啟動子前增加的通用增強子元件，可以進一步實現轉座酶在PGCs中高效 特異表達；
[0022] 2)本發明所提供的基因轉移系統，特異于禽類PGCs，可以從基因表達特異性和強 度方面有效地提高轉座子介導外源基因在PGCs的基因轉移效率，從而更有效地提高轉基因 禽類制備效率；
[0023] 3)本發明提供的基于轉座子系統的基因轉移方法，操作簡單快捷、實驗重復性好， PGCs特異性強，生殖系基因轉移效率高。經過胚胎水平驗證，該方法能夠高效介導基因轉染 PGCs，因而可應用于多個生物技術領域:例如，a)使用本發明中給出的方法可有效地將目的 基因盒整合到宿主PGCs基因組中，提高禽類胚胎生殖系轉基因效率，顯著提高禽類轉基因 效率;b)可以應用于制備轉基因禽類生物反應器，在蛋清中生產人源珍貴藥用蛋白。
【附圖說明】
[0024] 圖1是PCR擴增vasa啟動子產物電泳圖。