一種快速鑒定產氨基甲酸乙酯酵母的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速鑒定產氨基甲酸乙酯酵母的方法，屬于生物技術及食品安全 領域。
【背景技術】
[0002] 氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)是一種潛在的多位點致癌物，廣泛存在 于多種發酵食品和酒精飲料中，如面包、白酒、醬油等。形成EC的前體物質主要有瓜氨酸、尿 素、氰化物以及氨甲酰磷酸，他們能自發與乙醇發生化學反應形成EC。其中，尿素是形成EC 的最重要的前體物質。在發酵過程中，尿素主要是是由酵母代謝精氨酸所產生。在酵母的精 氨酸代謝途徑中，carl編碼精氨酸酶，是該途徑中的第一個酶，參與精氨酸的分解代謝形成 尿素。
[0003] 在酵母中，編碼精氨酸酶的carl呈現出多樣性，而目前大量的報道集中于釀酒酵 母。傳統食品發酵過程中由多種酵母共同參與，如pichia，Candida，Saccharomyces等。目前 所報道的carl序列不多，由已知的公開的carl序列比對發現，在不同酵母種屬中序列差異 很大，以至于目前還沒有一種引物能同時檢測不同酵母的carl基因。
[0004] 我國發酵食品種類繁多，而我國對發酵食品中EC的研究主要集中在檢測方面。當 前迫切需要跟蹤我國各類發酵食品的發酵過程，對EC的形成機制作深入研究。為了深入了 解發酵食品發中能產EC的酵母，有必要建立起一種快速鑒定產EC酵母的方法，為之后進一 步用微生物手段控制發酵食品中氨基甲酸乙酯形成提供了思路。
【發明內容】
[0005] 為了克服上述問題，本發明提供了一種用于產氨基甲酸乙酯酵母快速檢測的引物 及其應用。
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種可快速檢測酵母是否具有產氨基甲酸乙酯潛力 或者可快速對酵母種屬進行分類的引物對，所述引物對：
[0007] (1)由核苷酸序列為NCCNCCNBBNACNSKNGTNCCNGTNG(如SEQ ID N0.1 所示）和核苷 酸序列為TGGWTNGAYGCNCAYGCNGAYATHAA(如SEQ ID N0.2所示）的核苷酸片段組成;或者是
[0008] (2)由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2的序列同時進行反向互補后得到的兩個核苷酸 片段組成。
[0009] 本發明的第二個目的是提供所述引物對在檢測樣品中是否存在具有產氨基甲酸 乙酯潛力的酵母的應用。
[0010]在本發明的一種實施方式中，所述樣品是來自任意含有酵母的發酵食品體系的樣 品，或者是從發酵食品體系中篩選得到的酵母的菌落、發酵液、菌體，或者是含有酵母基因 組的樣品。
[0011]在本發明的一種實施方式中，所述發酵食品體系所指的發酵食品是白酒、黃酒、食 醋、泡菜、醬油、酸奶、干酪、酒釀、豆豉、乳腐、黃酒、啤酒、葡萄酒中的任意一種。優選的發酵 食品體系為白酒發酵體系、黃酒發酵體系或食醋發酵體系。
[0012]在本發明的一種實施方式中，所述酵母是以下任意一種或者多種：Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae，Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia oriental is，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens， Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibuligera、Schizosaccharomyces pombe、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Steri gmatomyces e1viae、 Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae^Cryptococcus neoformans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、 Brettanomyces custersianus^Debaryomyces hansenii或者Candida apicola〇 [0013]在本發明的一種實施方式中，所述酵母，來自白酒發酵體系，包括Saccharomyces cerevi siae(來自清香型或芝麻香型白酒）、Pichia farinosa(清香型白酒）、 Saccharomycopsis fib uligera(清香型白酒）、Clavispora lusitaniae(清香型白酒）、 Issatchenkia orientalis(清香型或芝麻香型白酒）、Pichia membranifaciens(清香型或 醬香型白酒）、Pichia anomala(芝麻香型白酒）、Hanseniaspora osmophila(清香型白酒）、 Schizosaccharomyces pombe(濃香型白酒）。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述具有產氨基甲酸乙酯潛力的酵母是指含有精氨 酸酶編碼基因的酵母。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述檢測是指利用引物對進行PCR，如果PCR產物檢 狽L顯示具有250-500bp之間（具體是在330bp左右）的片段，則代表該酵母具有carl基因，即 該酵母具有產生氨基甲酸乙酯的潛能。PCR產物如果不在250-500bp之間（具體是330bp左 右)或者沒有條帶，則代表該酵母不具有carl基因，也就不具備產氨基甲酸乙酯的潛能。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述PCR是先提取樣品的基因組再進行PCR或者直接 對酵母菌液進行PCR;
[0017] 在本發明的一種實施方式中，所述PCR擴增使用25微升反應體系:所述反應體系為 2XTaq PCR MasterMix(with loading dye)12.5微升，兩種簡并引物各0.5微升，酵母DNA 模板1微升，加水至總體積25微升;PCR擴增的條件為:94°C4分鐘，94°C1分鐘，50°C30秒，72 °C1分鐘，72°C10分鐘(40個循環）；
[0018] 本發明的第三個目的是提供一種快速檢測酵母種屬的方法，所述方法是使用所述 的SEQ ID N0.1和SEQ ID勵.2的引物對對含有酵母基因組的樣品進行?0?，將得到的？0?產 物的序列在NCBI上進行比對，從而得知酵母的屬種。
[0019] 所述酵母是以下任意一種或者多種:Pichia farinosa，Clavispora lusitaniae， Hanseniaspora osmophila，Issatchenkia orientalis，Kazachstania exigua，Pichia anomala，Pichia membranifaciens，Saccharomyces cerevisiae，Saccharomycopsis f ibul igera或者Schizosaccharomyces pombe、Schizosaccharomyces pombe、Pi chia fermentans、Trichosporon asahi i > Sterigmatomyces elviae、Zygosaccharomyces bailii、Kodamaea ohmeri、Pichia deserticola、Pichia galeiformis、Pichia fabianii、 Geotrichum candidum、Stephanoascus ciferrii、Pichia meyerae、Cryptococcus neof ormans、Trichosporon jirovecii、Trichosporon asahii、Brettanomyces custersianus、Debaryomyces hansenii或者Candida apicola。
[0020] 本發明的第四個目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對或SEQID NO. 1/SEQ ID NO.2同時反向互補得到的引物對在宏基因組方面的應用。所述應用，是用所 述引物對進行含有宏基因組的樣品的PCR，通過PCR結果判定樣品中是否含有具有產氨基甲 酸乙酯潛力的酵母(如果PCR產物檢測，顯示具有330bp左右的片段，則代表該宏基因組中有 carl的存在，即該環境樣品中存在產氨基甲酸乙酯酵母的存在；PCR產物如果不在250-500bp(具體是在330bp左右）范圍或者沒有條帶，該宏基因組中沒有carl的存在，即該環境 樣品中不存在產氨基甲酸乙酯酵母），和/或根據PCR產物的測序結果判定酵母的屬種。
[0021] 本發明的第五個目的是提供所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對或SEQID NO. 1/SEQ ID N0.2同時反向互補得到的引物對在DGGE分析微生物方面的應用。所述應用， 是用所述引物對進行含有微生物基因組的樣品的PCR，通過PCR結果判定樣品中是否含有具 有產氨基甲酸乙酯潛力的酵母，和/或根據PCR產物的測序序列在在NCBI上的比對結果判定 酵母的屬種。
[0022] 本發明的第六個目的是提供一種獲得不同種屬的酵母的精氨酸酶基因序列的方 法，是使用所述的SEQIDN0.1/SEQIDN0.2的引物對或SEQIDN0.1/SEQIDN0.2同時反 向互補得到的引物對對酵母基因組進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行測序(或者進一步根 據PCR測序結果設計引物對擴增產物的上下游序列進行擴增，進而得到全長的精氨酸酶基 因序列），即得到精氨酸酶基因序列。
[0023] 在本發明中，使用SEQ ID N0.1/SEQ ID勵.2的引物對樣品進行?0?時，引物對的 各引物的濃度為lOngAU-lOOOngAU。
[0024]在本發明中，使用SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2的引物對（或SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO.2同時反向互補得到的引物對)樣品進行PCR時，PCR擴增使用25微升反應體系:所述反應 體系為2XTaq PCRMasterMix(with loading dye)12.5微升，兩種簡并引物各0.5微升，酵 母DNA模板1微升，加水至總體積25微升;PCR擴增的條件為:94°C4分鐘，94°C 1分鐘，50°C30 秒，72°C 1分鐘，72°C 10分