Capri細胞及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及CAPRI細胞及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤的生物治療現已被廣泛作為除手術、放療及化療之外的第四種療法。目前比 較常見的療法有樹突狀細胞(DC)療法、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)療法等。
[0003] DC療法的方案是從患者的外周血淋巴細胞中分離出DC細胞前體即單核細胞，經 IL-4、GMCSF及TNF等細胞因子激活，獲得有抗原呈遞功能的DC，在DC成熟的過程中可加入患 者腫瘤溶解物或合成腫瘤多肽或腫瘤細胞系溶解物或腫瘤抗原mRNA等腫瘤信息分子，終產 品DC為攜帶腫瘤信息的抗原呈遞細胞。在臨床應用時，可將DC作為疫苗接種給患者，誘導患 者的免疫防御，從而達到在體內活化激活腫瘤特異性殺傷細胞的作用。
[0004] CIK療法的方案是從患者外周血PBMC中分離出以T細胞為主的淋巴細胞，通過液相 中的小鼠抗人CD3抗體激活T淋巴細胞，并使用IL-2等能夠維持T細胞高速大量增殖的細胞 因子獲得大量以⑶56+/⑶3+表型的NKT細胞，通常以50ml外周血中的淋巴細胞作為起始，經 過14-20天的培養，獲得十億以上的細胞，這些細胞通過靜脈回輸給腫瘤患者，以提高腫瘤 患者免疫功能，通過以非特異性殺傷為主的殺傷作用抑制腫瘤及微小轉移。現在也有將DC 技術結合CIK技術的報道，方案為在DC培養成熟后(7-10天)加入單獨培養的CIK細胞再次培 養(7-10天），培養后的DC及CIK混合物再回輸患者。
[0005] 然而，腫瘤的以下特性會為腫瘤的細胞治療方案造成困難:1、腫瘤的多樣性造成 各瘤種的特異性抗原不同，從而對依賴于特異性抗原的細胞培養方法造成影響。2、腫瘤在 其形成、生長及轉移的過程中，細胞表面所表達的腫瘤抗原會產生突變。3、腫瘤本身具有異 質性。4、腫瘤在體內能夠分泌諸如IL-6、IL-4、IL-10等能夠誘導免疫抑制或Th2、Thl7等不 利于細胞免疫的細胞因子，造成腫瘤殺傷免疫應答的不足。
[0006] 以上幾個腫瘤特性均對DC療法的方案造成了不利的影響，首先，由于腫瘤的多樣 性及腫瘤抗原的突變造成DC療法中選取普適的腫瘤抗原成為不可能完成的任務，其次，隨 著腫瘤惡性程度的發展及從原發腫瘤到轉移腫瘤的病情發展過程，腫瘤的抗原在不斷改 變，使得在DC制備過程中加入的原發腫瘤抗原、細胞系抗原、合成多肽等失去其作用，因為 載有以上抗原的DC誘導的殺傷細胞的攻擊對象在患者體內不復存在，而大量不表達以上抗 原的變異轉移腫瘤細胞又不能被識別殺傷。此外，DC方案依賴于患者本身的免疫應答，而患 者往往由于腫瘤所分泌的細胞因子及腫瘤術后的放化療，處于免疫抑制狀態。DC在進入患 者體內后，往往不能有效誘導免疫應答。
[0007] 對于非特異性殺傷的治療方案，例如CIK療法，其不足在于，以NK及NKT為主的殺傷 會受到自體MHC-C分子的抑制。在自體系統內，NK及NKT細胞不能殺傷表達MHC分子的腫瘤細 胞，大量的臨床試驗表明，超過80 %的腫瘤細胞表面表達MHC分子，少量晚期腫瘤細胞由于 染色體丟失、甲基化或其他分子生物學改變才會有MHC-C分子不表達的情況，在對60例自體 腫瘤的CIK細胞殺傷試驗中，發現平均殺傷率為7.35± 1.66%，僅2例殺傷率超過30%。而在 MHC不配型的異體系統的殺傷率則可高達85%。因此在CIK療法中MHC-C對非特異性殺傷的 抑制作用是其主要缺陷。此外在CIK療法中細胞是從新鮮培養物中獲取直接回輸患者，造成 制備安全性及臨床配合度方面的困擾。而且，傳統療法均需長期(一般超過14天）的細胞培 養，不僅增加了工作量，設備占用率高，提高了細胞培養成本，而且細胞培養物的污染幾率 倍增。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種耗時短、方便簡潔并且不需要另外加入抗原成分的體外 激活和誘導方法，從而獲得級聯式細胞因子誘導激活的腫瘤特異性殺傷T淋巴細胞(CAPRI 細胞）。
[0009] 為了實現本發明目的，本發明提供的CAPRI細胞的制備方法，該方法包括外周血單 核細胞體外激活以及CAPRI細胞擴增的步驟；
[0010]所述外周血單核細胞體外激活是將外周血單核細胞用0KT3抗體(抗CD3抗體)進行 初級刺激后，在存在細胞因子組合I的情況下進行體外激活培養;細胞因子組合I包括rhlL-2(重組人白細胞介素-2)和rhIFN-γ (重組人干擾素 -γ )，以及rhIL-4(重組人白細胞介素-4)、rhGM_CSF(重組人粒細胞集落刺激生物因子）、rhTNF_a(重組人腫瘤壞死因子-a)、PGE_2 (前列腺素 E2)中的至少一種；
[00?1 ] 所述CAPRI細胞擴增是將未經上述體外激活處理的外周血單核細胞與經過上述體 外激活處理的外周血單核細胞混合孵育，在存在細胞因子組合II的情況下進行CAPRI細胞 擴增培養;細胞因子組合11包括也11^-2和^1正1丫，以及也11^-7(重組人白細胞介素-7)和/ 或IL-15(白細胞介素-15)。
[0012]本發明所述CAPRI細胞由自體同源的或同種異體的細胞構成。
[0013]前述的方法，未經體外激活處理的外周血單核細胞與經過體外激活處理的外周血 單核細胞按1:10-1 〇: 1的比例混合，優選按1:1的比例混合。
[0014] 前述的方法，在進行初級刺激之前，先從患者外周血中分離、純化單核細胞，具體 方法為：抽取患者外周血，加肝素抗凝處理，然后分裝至離心管中1500g離心20分鐘，棄上 清，向離心管中加入RPMI1640培養基100-200ml，制成淋巴細胞懸液，然后加入到預置有淋 巴細胞分離液的離心管中，離心后將淋巴細胞層轉移至另一離心管中，加 RPMI 1640培養 基重懸，750g離心5-12分鐘，棄上清，重復以上重懸、離心操作1次，向獲得的單核細胞中加 完全培養液，制成淋巴細胞懸液;或者，采用白細胞分離技術從患者外周血中獲得單核細 胞，向獲得的單核細胞中加完全培養液，制成淋巴細胞懸液。
[0015] 所述完全培養液的制備方法為:全血于1500g離心20分鐘，棄上清，4°C靜置過夜， 再于1500g離心15分鐘，取上清作為培養基中添加的血漿;向RPMI 1640培養基中加入血漿， 并按100U/ml濃度加入慶大霉素，制成含ΙΟv/v%自身血漿的完全培養液。
[0016] 所述外周血單核細胞體外激活的具體方法為：
[0017] 1)細胞培養瓶處理：用PH8.6的PBS緩沖液配制濃度為2μg/ml的0KT3抗體包被液， 向75cm2細胞培養瓶中加入12ml包被液，4°C過夜處理，使用前去掉包被液，用生理鹽水洗1-2次，然后每瓶加入18ml完全培養液；
[0018] 2)體外激活：向上述培養瓶中加入含6 X107個單核細胞的淋巴細胞懸液12ml，于 38°C，6%C02培養箱中培養3小時，進行初級刺激;3小時后加入激活培養基I 0.5ml，繼續培 養3小時，獲得體外激活的外周血單核細胞。
[0019] 其中，所述激活培養基I中含rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-y 10-2000IU/ml、 rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-a200-500IU/ml及PGE-2 l-5μg/ml， 以水配制。
[0020] 所述CAPRI細胞擴增的具體方法為：向體外激活的外周血單核細胞中加入含3 X 107-6X107個單核細胞的淋巴細胞懸液12ml，于38°C，6%C02培養箱中孵育16小時，然后于 750g離心8分鐘，棄上清，用RPMI1640培養基重懸細胞，800g離心5分鐘后，棄上清，用RPMI 1640培養基或完全培養液重懸細胞，使細胞濃度達到1 X 106-5 X 106個/ml，加入激活培養基 II，于38°C，6%C02培養箱中培養72小時，進行CAPRI細胞擴增。
[0021] 其中，所述激活培養基II中含rhIL-2 100-2000IU/ml、rhIFN-y 100-2000IU/ml、 rhIL-7 10-200IU/ml及IL-15 10-300IU/ml，以水配制。
[0022] 前述的方法，還包括CAPRI細胞收獲、凍存及復蘇的步驟，具體如下：
[0023] CAPRI細胞收獲的方法為:將CAPRI細胞擴增培養物800g離心10分鐘，棄上清，用生 理鹽水重懸細胞，同時取樣送質量控制檢測；
[0024]凍存的方法為:將生理鹽水重懸的細胞800g離心10分鐘，棄上清，并用4ml冷凍液A 重懸，置于冰上，加入4ml預冷的冷凍液B，分裝后保存于液氮或-80°C冰箱中；
[0025]復蘇的方法為:將待復蘇的細胞于37°C水浴中解凍，并轉移到預置有10ml細胞復 蘇液的離心管中，750g離心5分鐘，然后用生理鹽水重懸細胞，再750g離心5分鐘，重復以上 重懸、離心操作步驟3次;最后用2ml細胞復蘇液重懸，準備回