一種體外牙菌斑生物膜模型及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物膜的體外模型，屬于生物領(lǐng)域及口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一 種體外牙菌斑生物膜模型。
【背景技術(shù)】
[0002] 口腔里生存著多種多樣的微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、原蟲等，其存在 形式包括游離態(tài)和聚集態(tài)。游離態(tài)的微生物稱為浮游微生物。聚集態(tài)形式的微生物稱為生 物膜。和浮游微生物相比，以生物膜存在的微生物群具有以下特點(diǎn)：
[0003] 1)微生物之間相互積聚和定殖，具有空間和環(huán)境的多樣性;2)活性強(qiáng)，能夠抵御苛 刻的環(huán)境而存活;3)耐受性強(qiáng)，對抗生素敏感性下降;4)能表達(dá)不同于浮游細(xì)菌的表型。
[0004] 生物膜中微生物的生存能力、抗藥性、代謝效率均顯著高于浮游微生物;兩者呈現(xiàn) 完全不同的生理特征。而長期以來，口腔護(hù)理產(chǎn)品的效能，尤其是抗菌效能，是采用浮游微 生物(主要是游離的細(xì)菌)作為研究對象。其結(jié)果與真實(shí)的口腔情況存在很大的差異，難以 指引口腔產(chǎn)品的開發(fā)和優(yōu)化。
[0005] 由于口腔產(chǎn)品的臨床實(shí)驗(yàn)成本高昂，試驗(yàn)周期動(dòng)輒數(shù)月，而且實(shí)驗(yàn)對象存在很大 的特異性；導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性難以保證。增加樣本數(shù)量會(huì)導(dǎo)致測試成本進(jìn)一 步增加。因此，迫切需要建立一種體外的口腔生物膜模型;這種模型盡可能地模擬口腔的情 況，而且能夠保證多次測試具有重復(fù)性。
[0006] 牙菌斑生物膜是口腔環(huán)境中的主要生物膜，是導(dǎo)致口腔疾病如齲齒，牙齦炎，牙周 炎和口源性口臭病產(chǎn)生的主要原因之一。牙菌斑生物膜的各種微生物粘附在牙齒表面和口 腔其它軟組織上，其組成以細(xì)菌為主。細(xì)菌包括兼性厭氧菌和嚴(yán)格厭氧菌。
[0007] 目前針對體外的牙菌斑生物膜的研究分為動(dòng)態(tài)法和靜態(tài)法兩種。動(dòng)態(tài)法是在人工 唾液模擬口腔流動(dòng)環(huán)境下形成牙菌斑生物膜。專利CN2628532Y、CN1480110A、CN200952006Y 和CN1858200A公開了一系列用于篩選防齲藥物效能的動(dòng)態(tài)生物膜模型。CN201952427U公開 了一種人工口腔模擬動(dòng)態(tài)牙菌斑生物膜裝置，該模型包括培養(yǎng)基罐，多通道栗，流動(dòng)室，藥 物樣品溶液瓶，廢液收集罐等組成，所述的菌種培養(yǎng)是以人的唾液或菌斑作為生物膜的菌 種來源。
[0008] 動(dòng)態(tài)模型存在以下問題：
[0009] 1)每個(gè)檢測周期可檢樣品數(shù)少，目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測周期一般是5至7天，每次最 大可檢樣品數(shù)低于5個(gè)；
[0010] 2)測試結(jié)果的重復(fù)性難以保證，目前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果均采用單次的數(shù)據(jù)；
[0011] 3)設(shè)備非常復(fù)雜，一般必須包含發(fā)酵、培養(yǎng)、尾氣/廢液處理、溫控設(shè)備幾個(gè)模塊， 需要大量的連接管道保持氣體環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境；
[0012] 4)設(shè)備成本高昂，厭氧發(fā)酵罐一臺(tái)成本動(dòng)輒在二十萬以上；
[0013] 5)研究處于初期階段；目前沒有市售的整套儀器，而不同文獻(xiàn)中的設(shè)備多為自行 構(gòu)建，難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)難以建立關(guān)聯(lián)。
[0014] 靜態(tài)法是以特定菌種經(jīng)歷培養(yǎng)后，在成膜介質(zhì)上形成生物膜。典型的模型如 Zurich 模型，具體如文南犬 Guggenheim B, et al, Validation of an in vitro Biofilm Model of Supragingival Plaque.J DentRes.2001;80(l):363-370。靜態(tài)法制備步驟決定 了成膜介質(zhì)上面生長和附著的微生物既有游離態(tài)(浮游微生物)也有聚集態(tài)(生物膜）。必須 盡可能地清除浮游微生物，并最大限度地保留生物膜才能保證生物膜模型測試結(jié)果的可信 度。因此，生物膜與成膜介質(zhì)的結(jié)合穩(wěn)定程度決定生物膜模型的成功與否。除此以外，特定 菌種的培養(yǎng)環(huán)境也會(huì)嚴(yán)重影響生物膜的效果。
[0015] 羥基磷灰石片是一種常見的成膜介質(zhì)，由于其疏松多孔的特性，能夠使微生物聚 集并致密地附著于其表面形成穩(wěn)定的牙菌斑。但兩者結(jié)合非常緊密。羥基磷灰石片表面的 生物膜難以使用水流沖刷、溶劑浸泡、超聲振蕩等方式清洗下來而不傷害其表面。因此，羥 基磷灰石片只能單次使用，從而導(dǎo)致了檢測費(fèi)用高昂，不適合用于大批量產(chǎn)品或者原料的 檢測。此外，不同的羥基磷灰石片表面孔隙大小及疏密度等方面存在差異，會(huì)對生物膜產(chǎn)生 一定的影響，將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間存在偏差。
[0016] 綜上可知，業(yè)界迫切需要構(gòu)建一種簡單快捷，價(jià)格低廉，單次樣品數(shù)多，檢測結(jié)果 重復(fù)性好的牙菌斑生物膜模型。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種價(jià)格低廉、操作簡易、穩(wěn)定性高、重復(fù)性強(qiáng)的體外牙菌斑 生物膜模型，以消除現(xiàn)有技術(shù)的某些缺陷。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種每次能檢測多個(gè)樣品的牙菌斑生物膜模型的制 備方法，而且該模型的測試結(jié)果具有良好的重復(fù)性。
[0019] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的方法是通過采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0020] -種體外牙菌斑生物膜模型，在無氧氣氛下，以厭氧菌培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)，以口 腔致病菌作為菌種，以表面親水改性處理(TC處理）的細(xì)胞培養(yǎng)板作為成膜介質(zhì)，以培養(yǎng)介 質(zhì)對口腔致病菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，在成膜介質(zhì)上生長一段時(shí)間，然后進(jìn)行浮游微生物的去 除，最后在成膜介質(zhì)的表面獲得牙菌斑生物膜。
[0021] 所述的口腔致病菌選自嚴(yán)格厭氧菌和兼性厭氧菌的一種或多種的混合物。所述的 口腔致病菌選自血鏈球菌（Streptococcus sanguis)、變異鏈球菌（Streptococcus mutans)、粘性放線菌（Actinomyces viscosus)、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、牙銀卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)、中間普氏菌（Prevotella intermedia)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)的一種或多種的混合物。
[0022] 所述的厭氧菌培養(yǎng)基選自胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)補(bǔ)加培養(yǎng)基和腦心浸出液肉湯 (BHI)富集培養(yǎng)基。所述的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)補(bǔ)加培養(yǎng)基是指每升胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB)培養(yǎng)基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅素、1毫 克維生素 K1。所述的腦心浸出液肉湯(BHI)富集培養(yǎng)基是指每升腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng) 基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅 素、1毫克維生素 K1。
[0023] L-半胱氨酸氨酸鹽酸鹽、氯化血紅素和維生素 K1以溶液的方式添加至胰蛋白胨大 豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，所述溶液具有以下的配置步驟：
[0024] 1 )0.5g/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液:將0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽溶解于1毫升去 離子水中，經(jīng)0.22μπι無菌濾膜過濾，保留濾液，儲(chǔ)存溫度為4°C;
[0025] 2) 5g/L氯化血紅素水溶液：將0.5克氯化血紅素和1.74克磷酸氫二鉀，溶解于 100ml去離子水中，煮沸助溶，0.22μπι濾膜過濾，保留濾液，盛載濾液的容器以錫箱紙包裹外 表面并避光儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度為4°C;
[0026] 3)5g/L維生素 K1乙醇溶液:將50毫克維生素 K1溶解于10毫升無水乙醇中，盛載溶 液的容器以錫箱紙包裹外表面并避光儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度為4°C。
[0027] 8、如權(quán)利要求6所述的體外牙菌斑生物膜模型，其特征在于:所述L-半胱氨酸氨酸 鹽酸鹽、氯化血紅素和維生素 K1以溶液的方式添加至腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，所述溶 液具有以下的配置步驟：
[0028] 1 )0.5g/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液:將0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽溶解于1毫升去 離子水中，經(jīng)0.22μπι無菌濾膜過濾，保留濾液，儲(chǔ)存溫度為4°C;
[0029] 2) 5g/L氯化血紅素水溶液：將0.5克氯化血紅素和1.74克磷酸氫二鉀，溶解于 100ml去離子水中，煮沸助溶，0.22μπι無菌濾膜過濾，保留濾液，盛載濾液的容器以錫箱紙包 裹外表面并避光儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度為4°C;
[0030] 3)5g/L維生素 K1乙醇溶液:將50毫克維生素 K1溶解于10毫升無水乙醇中，盛載溶 液的容器錫箱紙包裹外表面并避光儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度為4°C。
[0031 ]所述無氧氣氛具體組成為:按體積比計(jì)，包含80 %氮?dú)猓?0 %氫氣，10 %二氧化碳； 所述表面親水改性處理(TC處理）的細(xì)胞培養(yǎng)板為聚苯