一種有機廢棄物的耐高溫腐熟菌劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵、廢棄物資源化利用領域，特別涉及一種可以快速腐熟有 機廢棄物的耐高溫腐熟菌劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 有機廢棄物包括作物秸桿、畜禽糞便、城市生活垃圾、污泥等。我國為農業大國，農 業廢棄物及畜禽糞便年產量達40億噸以上，而城市生活垃圾年產量也達到了 2.5億噸以上， 如此巨大的可再生資源，并未得到充分的利用。
[0003] 目前，高溫好氧堆肥逐漸成為處理有機廢棄物的重要途徑，可實現無害化、減量化 和資源化。國內外學者針對堆肥腐熟菌劑開展了大量工作，并取得了豐厚的成果，但高溫環 境對腐熟菌劑的影響依舊值得深入探討，堆肥化中有機廢棄物主要降解過程在堆肥高溫 期，而高溫環境抑制了大部分常溫微生物，CN 102010824、CN 1772880等公布了多種由枯草 芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、酵母菌、小孢鏈霉菌、康寧木霉等微生物構成的復合微生物菌劑， 但這些微生物活性在高溫環境下會受到明顯的抑制，大幅降低微生物活性，減緩腐熟進程， CN 102851246公布了嗜熱棲熱菌在堆肥中的應用，棲熱菌具有較好的溫度適應性，但其生 物量僅有1〇4~l〇 6cfu/g，發酵周期長，產酶活性相對較低，不適合大規模推廣。
[0004] 在有機廢棄物堆肥中接種耐高溫菌劑，可有效提高有機質分解速率，縮短發酵周 期，提高堆肥制品的質量。目前有機物料腐熟劑采用耐高溫芽孢桿菌的報道并不多見。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了解決現有腐熟劑在有機廢棄物處理中的應用缺陷，針對其升 溫慢、溫度不穩定、微生物活性低及發酵周期長等問題，提供一種能耐受高溫環境，且生物 酶活性好的有機廢棄物的腐熟菌劑。
[0006] 本發明的另一目的是提供上述耐高溫腐熟菌劑的應用。
[0007] -種腐熟有機廢棄物的耐高溫腐熟菌劑，其特征在于：命名為：枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)Hl-7,保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC N0: M2015174。
[0008] 進一步地，所述H1-7菌劑，在55°C的環境中生長良好，55°C時的α-淀粉酶活可達 62. lU/mL，蛋白酶活為673.2U/mL，纖維素酶活為6.75U/mL。
[0009] 上述菌劑在有機廢棄物堆肥中的應用。
[0010] 進一步地，應用方法如下：將所述H1-7菌劑的發酵液和市售有機廢腐熟劑按1:10 ~20的質量比混合，以0.2%~0.5%的接種量接入有機廢棄物堆體發酵，可加快有機廢棄 物腐熟。
[0011]進一步地，所述H1-7菌劑發酵液的培養為:將H1-7菌株保藏斜面進行活化，挑取單 菌落接入LB液體培養基，37°C恒溫培養8-12h，種子液接入發酵培養基，起始pH 6.5~8.0， 裝液量10~50mL，接種量0.1~5%，置于20~45°C恒溫培養，轉速100~240r/min，發酵24~ 48h〇
[0012] 進一步地，所述的發酵培養基為：葡萄糖1~25g/L，豆柏10~50g/L，K2HP〇4 0.1~ 2.5g/L，MgS〇4 0.1~2.0g/L。
[0013] 進一步地，所述市售有機廢棄物腐熟劑，含有黑曲霉孢子107個/g，解淀粉芽孢桿 菌108CFU/g。
[0014] 本發明提供的有機廢棄物的耐高溫腐熟菌劑，針對堆肥高溫期溫度大于55°C的特 點，篩選能耐受55°C以上高溫的芽孢桿菌，具有更好的微生物代謝活性，良好的產酶特性， 有利于有機廢棄物的分解。與現有有機廢棄物微生物處理技術相比，本發明的有益效果表 現在：1、通過堆肥初期接種耐高溫菌劑，快速提高堆體溫度，耐高溫菌劑能在高溫環境下能 夠維持較好的降解效果，具有更強的環境適應性，加速了堆肥化進程;2、本菌劑微生物構成 簡單，制備方便，利于推廣。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發明實施例提供的B.subtilis H1-7菌株16S rDNA序列分析。
[0016] 圖2為本發明實施例提供的堆肥過程中不同處理溫度的變化。（注:CK:不接種微生 物菌劑;T1:接種市售腐熟劑;T2:接種市售腐熟劑+耐高溫腐熟劑。）
[0017] 圖3為本發明實施例提供的堆肥過程中不同處理微生物的變化。（注:實心圖標為 常溫細菌(37°C培養），空心圖標為高溫細菌(55°C培養)）
[0018] 圖4為本發明實施例提供的堆肥過程中不同處理有機質的變化。
[0019] 圖5為本發明實施例提供的堆肥過程中不同處理種子發芽率的變化。
【具體實施方式】
[0020] 現結合實施例對本發明進行詳細的說明。
[0021 ]實施例1:本發明實施例提供的耐高溫芽孢桿菌H1-7的篩選及鑒定
[0022]從自然堆肥及活性污泥中取樣，利用梯度稀釋涂布法分離微生物。將稀釋涂布平 板放置55°C培養箱恒溫培養24h。挑選長勢較快菌株分離純化。用接種針將分離純化菌株點 接至淀粉平板、蛋白平板和纖維素剛果紅平板上。培養24h后觀察透明圈。通過測定透明圈 與菌落直徑比（見表1)進行初篩，初篩后進行液體產酶發酵復篩，從堆肥中獲得8株降解淀 粉、蛋白、纖維素效果較好的細菌(見表2)，其中H1-7菌株在55°C的環境下，產酶性能明顯優 于其他菌株，α-淀粉酶活可達62. lU/mL，蛋白酶活為673.2U/mL，纖維素酶活為6.75U/mL，對 有機廢棄物具有良好降解活性。
[0023]表1有機廢棄物降解菌的篩選
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[0026] 表2各菌株生物酶活(培養溫度:37°C)
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[0028] H1-7為從土壤、自然堆肥及活性污泥中篩選所得，其溫度耐受性好(在60°C的環境 下可正常生長），且在55°C條件下對淀粉、蛋白質及纖維素有較強的分解能力；篩選到的H1-7菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性，產芽孢，在LB平板上正反面均為白色，表面光滑，不透明，粘 稠、挑之拉絲、圓形突起的菌落形態;序列見序列表1。
[0029] 通過對H1-7菌株的16S rDNA序列分析，在GenBank核苷酸序列數據庫中進行Blast 比對搜索，選擇與H1-7同源性較高的序列進行系統發育學分析，結果如圖1所示。依據以上 結果可以認為H1-7菌株為芽孢桿菌屬，H1-7與枯草芽孢桿菌是同一種群菌株，并于2015年3 月27日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號:CCTCC N0:M2015174,保藏單位地址： 湖北省武漢市武漢大學(湖北省武漢市武昌區八一路299號）。
[0030] H1-7菌株液體菌劑的培養:將H1-7菌株保藏斜面進行活化，挑取單菌落接入LB液 體培養基，37°C恒溫培養8-12h，種子液接入發酵培養基:葡萄糖1~25g/L，豆柏10~50g/L， K2HPO4 0.1~2.5g/L，MgS〇4 0.1~2.0g/L，起始pH 6.5~8.0，裝液量10~5〇111以25〇11^錐形 瓶），接種量〇. 1~5 %，置于20~45°C恒溫培養，轉速100~240r/min，發酵24~48h，得到H1-7菌劑的發酵液。所得H1-7的發酵液芽孢總數可達80 X 108CFU/mL以上。
[0031] 下面結合耐高溫菌H1-7在有機廢棄物堆肥中的應用實施例對本發明進一步詳細 說明。
[0032] 實施例2本發明實施例提供的耐高溫菌H1-7在餐廚垃圾秸桿混合堆肥中的應用 [0033] 1、餐廚垃圾秸桿混合堆肥腐熟過程
[0034]將餐廚垃圾與秸桿(玉米秸桿、稻桿)按照濕基質比5:1進行混合，或根據物料理化 性質調整C/N比例，使混合物