硫辛酸修飾的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種改性的兩親三嵌段聚合物，具體涉及一種中間疏水性鏈段側鏈用 硫辛酸修飾的兩親三嵌段聚合物。
【背景技術】
[0002] 由于納米載體可以增強滲透和保留（EPR)效應，對抗癌藥物靶向控制釋放，近年 來，各種納米載體被開發用于改善癌癥化療效果。聚合物膠束作為一種納米載體，由于其優 異的性質：延長藥物循環時間，提高藥物溶解度以及增強EPR效應被動靶向腫瘤部位等能 力而廣泛應用于藥物輸送。兩親性聚合物通過分子間的相互作用在水中可以自組裝形成聚 合物納米膠束（Micelles)。納米膠束作為藥物載體進入體內，可以有效地減少人體網狀內 皮系統（RES)巨噬細胞的吞噬，能穿越細胞間隙，可通過人體最小的毛細血管及血腦屏障 (BBB)并被細胞組織吸收，釋放出抗癌膠束殺死癌變細胞。同時，納米膠束可以避免藥物活 性喪失，有利于藥物的貯藏和運輸。因此聚合物納米膠束在藥物的控制釋放上具有巨大應 用潛力。
[0003] 將末端官能化的親水鏈段作為大分子引發劑開環聚合反應形成具有疏水鏈段的 兩親結構，是制備兩親聚合物的最主要方法之一。常見的術端官能化的親水鏈段包括聚乙 二醇（PEG)、聚磷酸酯（PEEP)等。常用的可生物降解的疏水鏈段包括聚酯（聚己內酯，聚 丙交酯等）和聚氨基酸（如聚γ-芐酯-L-谷氨酸、聚γ-芐酯-L-天冬氨酸、聚苯丙氨酸 和聚亮氨酸等）。作為親水鏈段，聚乙二醇（PEG)具有高度的親水性和良好的生物相容性 及血液相容性，能被機體迅速排出體外而不產生任何毒副作用。作為疏水鏈段，天然和合成 的聚氨基酸具有良好的生物相容性，生物降解性，代謝產物對人體無害，且無免疫原性（Wu et al. Biomaterials，2013, 34 :5262-5272 ;Wang，et al. Soft Matter，2013, 9:692-699; Ding，et al. Polym. Chem. 2011，2 :2857-2864)。
[0004] 然而通過自組裝形成的兩親聚合物的聚集體如膠束、納米膠束、聚合物囊泡等 藥物載體往往不夠穩定，注入體內被血液大量稀釋而解離，造成藥物過早釋放而不能將 藥物輸送至靶向位點。通過共價鍵交聯是目前用來提高納米藥物載體穩定性的主要方 法。交聯可分為核交聯或殼交聯（Wu，et al.J. Control. Release，2012,164:338-345; Hu，et al.Macromolecules，2013,46 :6243-6256 ;Jin，et al.Soft Matter，2012,8 : 11809-11816)。但對于理想的藥物釋放載體而言，需要的是一種對體內環境敏感的可逆交 聯，g卩：在體內血液中非常穩定能長循環，進入細胞后，能對胞內環境具有響應性而解除交 聯，將藥物釋放出來。近年來，開發具有環境（PH、溫度、氧化還原環境等）敏感性的納米 載體成為研究熱點之一（Chen，et al.J. Control. Release，2013,169 :171-179 ;Zhong，et al. Biomacromolecules，2013,14 :3723-3730) 然而，到目前為止，關于可生物降解的、環境 敏感的、可逆交聯的納米藥物載體的報道較少。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種兩親三嵌段聚合物的制備及應用的方法。
[0006] 為達到上述目的，本發明具體技術方案是，一種兩親三嵌段聚合物，所述兩親三嵌 段聚合物的鏈段為一種親水性聚合物和兩種疏水性聚合物組成，中間鏈段的側鏈為硫辛酰 基。
[0007] 上述技術方案中，所述親水聚合物可選用的原料為本領域技術人員公知的原 料，所述親水性聚合物可選自但不限于：聚乙二醇；所述親水聚合物的分子量為1000~ lOOOODa。所述中間疏水性聚合物可選自但不限于：聚谷氨酸芐酯、聚天冬氨酸芐酯、聚 N-芐氧羰基賴氨酸中的一種；所述中間疏水性聚合物的分子量為500~5000Da。所述末端 疏水性聚合物可選自但不限于：聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚異亮氨酸中的一種；所述末端疏 水性聚合物的分子量為2000~lOOOODa。
[0008] 上述技術方案中，所述兩親三嵌段聚合物中間鏈段被硫辛酸修飾，其中硫辛酰基 的取代度（每個中間鏈段聚合物單元中硫辛酸的個數）為20~100%。
[0009] 制備上述兩親三嵌段聚合物的方法為本領域技術人員公知的技術，以硫辛酸修 飾的聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯-聚苯丙氨酸（PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe)的制備為例來說 明兩親三嵌段聚合物的制備方法，PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe聚合物可通過對開環聚合得到 的聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯-聚苯丙氨酸（PEG-PBLG-PPhe)的側鏈進行修飾得到：首先 用PEG-NHJ# BLG-NCA和Phe-NCA依次開環聚合得到PEG-PBLG-PPhe，然后用乙二胺將所 得聚合物胺解后再與硫辛酸發生酰化反應，制備一系列硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈段單元的 PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe，其合成路線如圖1所示。
[0010] 上述技術方案中，所述兩親三嵌段聚合物中硫辛酸修飾的聚谷氨酸鏈段單元可通 過加入的BLG-NCA與PEG、Phe-NCA的比例、反應時間、反應溫度等來調節。
[0011] 上述技術方案中，由于聚乙二醇作為親水鏈段，兩種聚氨基酸作為疏水鏈段，得 到兩親性三嵌段聚合物，可以自組裝形成納米膠束，然后可以通過還原劑如二硫代蘇糖醇 (DTT)對殼上的硫辛酰基的五元環進行交聯，來增加納米膠束的穩定性，形成殼交聯納米膠 束，這種殼交聯納米膠束對細胞內的還原環境敏感，能解除交聯。
[0012] 因此，本發明的另一目的為提供一種交聯納米膠束。
[0013] 為達到上述目的，本發明具體技術方案是，一種交聯納米膠束，所述納米膠束的外 冠親水層由親水性聚合物構成，中間殼由硫辛酸修飾的疏水性聚合物構成，內核疏水層由 疏水性聚合物構成。
[0014] 上述技術方案中，所述交聯納米膠束的粒徑為30~200納米，粒徑分布PDI為 0. 05 ~0. 35。
[0015] 制備上述交聯納米膠束的方法包括以下步驟：
[0016] (1)將上述兩親三嵌段聚合物通過自組裝形成納米膠束，所述納米膠束的外冠親 水層由親水性聚合物構成，中間殼由側鏈為硫辛酰基的疏水性聚合物構成，內核疏水層由 疏水性聚合物構成；
[0017] (2)將步驟（1)中納米膠束的中間殼層交聯，通過對硫辛酰基的五元環的交聯來 穩定納米膠束結構，得到殼交聯納米膠束。
[0018] 上述技術方案中，步驟（1)中所述兩親三嵌段聚合物在水中自組裝形成以兩種聚 氨基酸為疏水部分的尺寸穩定，分布均一的納米膠束，所述納米膠束的粒徑為30~200nm。
[0019] 上述技術方案中，步驟（2)中所述的交聯可采用但不局限于下列方法：
[0020] 利用疏基-二硫鍵交換（thiol-disulfide exchange)反應，通過1，4_二硫代-D， L-蘇丁醇（DTT)對步驟（1)所得納米膠束中的含二硫鍵的五元環進行化學交聯；其中，1， 4-二硫代-D，L-蘇糖醇（DTT)的用量相對于取代的硫辛酸的摩爾數的5~30%，納米膠束 能夠被成功交聯。
[0021] 上述技術方案所得殼交聯納米膠束的穩定性相對于沒有交聯的納米膠束大大提 高，即使稀釋100倍（模擬IV注射）也不發生解離；對150mM的氯化鈉鹽的水溶液穩定，粒 徑變化不大。
[0022] 上述技術方案所得殼交聯納米膠束在還原環境中可以被解交聯，用以解交聯的還 原劑可選自但不限于：含巰基的分子，如1，4_二硫代-D，L-蘇糖醇（DTT)，谷胱甘肽（GSH) 或含三價磷的化合物，如三（2-氯乙基）磷酸酯（tris(2-carboxyethyl)_phosphine， TCEP);例如當DTT的濃度為10mM的時候，上述殼交聯納米膠束會被解交聯。
[0023] 因為上述殼交聯納米膠束具有還原敏感性，所以可以應用所述殼交聯納米膠束作 為藥物載體，可提尚殼交聯納米膠束在體內血液循環時的穩定性，提尚交聯納米膠束被腫 瘤細胞內吞的效率，從而提高藥物的生物利用度，同時殼交聯納米膠束可方便排除體外。
[0024] 本發明的另一目的為提供上述殼交聯納米膠束的應用，所述殼交聯納米膠束作為 藥物載體的應用。
[0025] 為達到上述目的，本發明的具體技術方案為，應用上述兩親三嵌段聚合物作為藥 物載體的方法，包括以下步驟：
[0026] (1)藥物先溶在有機溶液中，再與所述兩親三嵌段聚合物的有機溶液共同攪拌，然 后再滴加二次水，將得到的溶液攪拌1小時后透析，得到包裹藥物的納米膠束；
[0027] (2)對形成的納米膠束加入5~30mol %相對于雙硫鍵的1，4-二硫代-D，L-蘇糖 醇（DTT)對殼上硫辛酰基進行交聯得到包裹藥物的殼交聯納米膠束。
[0028] 上述技術方案中，所述藥物可選自但不局限于：疏水性藥物中的一種。本領域技術 人員可以根據需要選擇所需包封的藥物分子。
[0029] 優選的技術方案中，PEG-pGlu (EDA-LA) 1Q-PPhe，其中，PEG具有優異的生物相容性， 在體內能溶于組織液中，能被機體迅速排出體外而不產生任何毒副作用，其安全性得到FDA 認證；聚氨基酸生物相容性好，在體內可被酶降解成小分子而被排出體外，其側鏈可以接上 藥物，交聯劑或者是能改進高分子的物理性質的側基；硫辛酸是FDA批準的一種內源性的 抗氧化劑，可以去除機體自由基，降低血糖。因此整個體系具有非常優良的生物相容性。
[0030] 由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：
[0031] (1)由于本發明的兩親三嵌段聚合物中間殼層的疏水鏈段側鏈修飾有硫辛酰基， 因此可以通過對兩親三嵌段聚合物自組裝形成的納米膠束進行交聯，得到穩定的還原敏感 性殼交聯納米膠束，該殼交聯納米膠束在細胞外和血液中不易解離，從而保證納米膠束包 封的藥物穩定；克服了藥物在體內易被泄漏、運載效率低等不足。
[0032] (2) -旦進入腫瘤細胞，殼交聯納米膠束在細胞還原性條件下則快速解交聯而解 離，藥物快速釋放出來，從而產生高效治療作用；
【附圖說明】 圖1是PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe兩親三嵌段聚合物的合成路線圖； 圖2是PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe載藥交聯膠束的制備及其在細胞內還原響應性藥物釋 放過程示意圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述：
[0034] 實施例一，合成聚合物 PEG-pGlu (EDA-LA) -PPhe2。(DP = 10, PEG :Mn = 5kDa)
[0035] 在氮氣保護下，將CH30-PEG-NH2(0. 3g，0. 06mmo)溶于干燥DMF(3mL)中，向其中 加入BLG-NCA(189. 4mg，0. 72mmol)，將體系升溫至35