一種結核分枝桿菌蛋白hbha及其表達方法和亞單位疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌蛋白HBHA及其表達方 法和亞單位疫苗。
【背景技術】
[0002] 肝素結合血凝素(HBHA)是M. tb、BCG、麻風分枝桿菌(M. leprae)等表面表達和分泌 的一種糖蛋白，可同時出現在菌體和培養液中。HBHA能夠粘附到上皮細胞和其他非吞噬細 胞，有利于M. tb從初次感染部位的體內擴散。
[0003] 翻譯后修飾對HBHA蛋白的免疫原性有重要影響。天然HBHA免疫小鼠后，不但能誘 導小鼠產生高水平IFN- γ和抗體，并且能夠有效減少感染小鼠的脾、肺臟荷菌量和病理改 變，其產生的免疫效果甚可達到BCG的相應水平。鑒于天然HBHA在預防結核病方面的重要作 用，需要對其進行大規模的純化制備以備進一步的進行臨床研究應用。但是大規模的純化 制備受表達系統的制約，如大腸桿菌表達系統表達的蛋白HBHA不能進行翻譯后修飾，恥垢 分枝桿菌表達的蛋白HBHA不適宜大規模生產等。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種畢赤酵母GS115表達的 結核分枝桿菌蛋白HBHA及亞單位疫苗，其目的在于獲取不含有除蛋白HBHA本身氨基酸序列 外的其他氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白HBHA，并對其進行大規模的純化制備以備進一步 的進行臨床研究應用，配合本發明提供的疫苗佐劑，用于預防結核病，由此解決了大規模的 純化制備受表達系統的制約的問題。
[0005] 本發明首先提供一種肝素結合血凝素蛋白（HBHA)，包含有：
[0006] 1)氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質；
[0007] 2)與序列SEQ ID NO: 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能蛋 白質的氨基酸序列。
[0008] 上述蛋白質的表達方法，是將核苷酸序列為SEQ ID N0:2的基因的的第267堿基由 原先的G突變為A;再將突變后的基因片段插入到畢赤酵母表達載體中，構成的重組質粒轉 入畢赤酵母中進行表達，純化后獲得目的蛋白。
[0009] 本發明另一個方面提供一種結核病亞單位疫苗，含有所述的HBHA蛋白和疫苗佐 劑；其中HBHA蛋白的濃度為0.25~0.75mg/mL:
[00?0]所述的亞單位疫苗中脂質體開$式的DTM疫苗佐劑的使用濃度如下:0.5~2mg/ml二 甲基雙十八烷基銨、含有〇. 25~0.75mg/mL的海藻糖，0.25~0.75mg/mL的單磷酰脂質A;
[0011] 所述的亞單位疫苗中溶液形式的PTM疫苗佐劑的使用濃度如下:0.25~0.75mg/mL 的海藻糖，〇. 25~0.75mg/mL的單磷酰脂質A，12.5~37.5mg/mL的聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA)〇
[0012] 本發明選利用畢赤酵母GS115菌株能夠表達出的蛋白HBHA無標簽且不含有除HBHA 本身氨基酸序列外的其他氨基酸序列，配合相應疫苗佐劑能夠取得下列較好的免疫反應效 果，免疫保護效果和高安全性。
【附圖說明】
[0013] 圖1:實施例4的PCR鑒定HBHA基因整合于畢赤酵母GS115染色體基因組和蛋白HBHA 的表達純化圖；
[0014]圖2 :實施例9的各組小鼠血清蛋白HBHA特異的IgG抗體、亞類及IgG2a/IgGl比值 圖；
[0015]圖3:實施例9的蛋白HBHA特異的小鼠脾細胞上清中細胞因子IFN- 丫水平圖。
[0016] 圖4為實施例10的氣溶膠攻擊感染免疫C57BL/6小鼠四周后各組的肺臟荷菌量圖。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不 用于限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼 此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0018] 本發明提供的畢赤酵母GS115表達的蛋白HBHA無標簽且不含有除HBHA本身氨基酸 序列外的其他氨基酸序列。本發明提供的結核病亞單位疫苗，含有所述的蛋白HBHA，其濃度 為0.25至0.75mg/mL，還含有以下兩組成分中的一組的：
[0019] 〇 · 5mg/ml至2mg/ml二甲基雙十八:院基銨、含有0 · 25至0 · 75mg/mL的海藻糖，0 · 25至 0.75mg/mL的單磷酰脂質A，為脂質體形式；
[0020] 含有0.25至0.75mg/mL的海藻糖，0.25至0.75mg/mL的單磷酰脂質A，12.5至 37.5mg/mL的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)，為溶液形式。
[0021] 所述蛋白HBHA(氨基酸序列為SEQ ID N0:1)，其編碼基因是對結核分枝桿菌標準 毒株H37Rv的HBHA基因 （SEQ ID N0:2)的第267堿基由原先的G突變為A獲得的，突變后的基 因，其在畢赤酵母中的顯著提高。
[0022]本發明提供的兩種疫苗佐劑，分別命名為DTM和PTM。
[0023] DTM疫苗佐劑含有lmg/ml至4mg/ml二甲基雙十八烷基銨、含有0.5至1.5mg/mL的海 藻糖(Trehalose)，0.5至1.5mg/mL的單磷酰脂質A，為脂質體形式。
[0024] PTM疫苗佐劑含有0.5至1.5mg/mL的海藻糖，0.5至1.5mg/mL的單磷酰脂質A，25至 75mg/mL的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)，為溶液形式。
[0025]全球有三分之一的人群感染結核分枝桿菌(M.tb)，其中5%_10%發展為活動性結 核病(ATB)。而卡介苗(BCG)作為目前全球范圍唯一預防結核病的疫苗能夠有效的預防嬰幼 兒重癥結核病如粟粒樣TB及結核性腦膜炎，但對預防成人肺TB的發生、發展的效果差異很 大。因而迫切需要發展新的結核疫苗，以提高對成人TB的預防效果。
[0026]結核病亞單位疫苗，可用來替代BCG或作為增強疫苗增強BCG免疫后的效應，是新 發展的控制TB的主要疫苗類型之一。而且，亞單位疫苗應用于免疫缺陷人群相對于BCG更為 安全。廣泛接受機體抗M. tb的感染主要是依靠細胞免疫應答，尤其是CD4+Th 1型應答在抗原 發感染上起重要作用，CD8+T細胞在阻止潛伏感染后的再激活，即成人肺TB的發生具有重要 作用。BCG免疫主要是誘導機體產生強的CD4+Thl型應答，因此，其在預防兒童的原發感染后 所致的原發重癥TB較為有效。但是，BCG免疫機體產生CD8+T細胞反應能力較弱，所以對預防 潛伏感染和成人肺TB的價值不大。HBHA是M. tb的黏附素，與M. tb感染后在體內的播散密切 相關，同時也是一個重要的T細胞抗原。業也證實，單獨利用天然HBHA免疫，可以增強BCG的 免疫保護效果。擬以該抗原為基礎，建立亞單位疫苗，利用其在誘導CD8+T細胞反應上應具 有較強的潛力，以補充BCG免疫的不足。M. tb許多蛋白的免疫原性弱，因而需要免疫刺激佐 劑來輔助蛋白誘導的免疫反應，如二甲基雙十八烷基銨，海藻糖等。二甲基雙十八烷基銨與 抗原聯合在不同類型動物模型均可誘導細胞和體液免疫反應。海藻糖是人工合成的分枝桿 菌細胞壁的免疫刺激成分。
[0027]巴斯德畢赤酵母表達系統不但具有原核細胞和真核細胞表達系統的特點，還具有 高表達、高穩定和高分泌的優點，適合工業化大規模生產。該菌能以甲醇作為唯一碳源時， 其醇氧化酶(Α0Χ)高表達。Α0Χ的合成是在轉錄水平調控的，基因啟動子ΡΑ0Χ具有明顯的調 控功能，可用于調控外源基因的表達。當A0X1基因的啟動子PA0X1受甲醇強烈誘導時其催化 活性很強。外源蛋白的高水平表達依賴于多拷貝基因的插入整合，引入Tn903Kan基因（抗 G418)后，有助于篩選高拷貝轉化子，酵母菌抵抗G418的能力與其整合質粒的拷貝數成正 比。因此，用含不同濃度G418的YEH)平板可篩選高拷貝轉化子。近幾年來，已經有許多M. tb 的外源蛋白在此系統中得到表達，包括培養濾液蛋白32(CFP32);熱休克蛋白70 (HSP70); MPT64;M.tb Rv0577基因；ESAT6等。
[0028] 本發明中佐劑成分TDB