一種dna高通量測序建庫方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因高通量測序技術領域，具體地，設及一種適用于復雜環境中生物 的DNA高通量測序建庫方法。
【背景技術】
[0002] 在二代和Ξ代測序技術中，構建高質量的測序文庫是高通量測序的關鍵因素。測 序文庫的質量直接決定測序產出的數據質量，進而對數據分析有著莫大的關聯。隨著高通 量測序技術的快速發展，各大試劑公司，包括Illumina、肥B、KAPA、Nugen等，已能提供多種 文庫制備的試劑或試劑盒，為DNA、RNA等形式的核酸樣品的建庫帶來極大的便利，但是，在 DNA核酸建庫方面，并不是所有物種的DNA都能夠順利完成文庫的構建。究其原因為運些DNA 樣品中含有大量雜質，特性與DNA相近，不能夠通過調整DNA提取條件去除干凈，且運些雜質 對建庫過程中酶反應產生抑制效應，使DNA修復不完全或接頭連接效率低，最終導致文庫產 出量低。比較有代表性的一種生物類型是海洋生物，如海帶、貝類等。利用上述各大公司提 供的建庫方法，海帶、貝類DNA仍然不能得到有效的文庫產出，因此迫切需要一種能夠有效 降低復雜環境中生物DNA雜質污染的影響，特別是降低海洋生物DNA中雜質污染的影響的建 庫方法。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于解決現有的高通量測序建庫方法中難W降低環境中雜質污染 的影響的問題，提供一種能夠有效避免環境雜質污染的DNA高通量測序建庫方法。
[0004] 為達到W上目的，本發明提供了一種DNA高通量測序建庫方法，包括W下步驟：
[0005] (1)對待測生物的基因組DNA進行片段化處理，獲得DNA片段化物料；
[0006] (2)對所述DNA片段化物料進行瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳膠塊，切取所述電泳膠塊 中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的大小的片段大40-60bp的片段范圍內的凝膠，回 收凝膠內的DNA獲得第一純化DNA;
[0007] (3)對所述第一純化DNA進行末端修復和在3'末端加 A，末端加 A后連接接頭序列獲 得連接產物。
[000引本發明所提供的DNA高通量測序建庫方法能夠在含有多糖、酪類物質、祗類、醋類 等雜質污染的復雜環境下對生物DNA進行高通量測序文庫構建，能夠將樣品中與DNA特性接 近的雜質去除，提高高通量測序文庫的質量。適用于那些按照本領域現有構建文庫方法，獲 得的文庫產出低，同時通過調節DNA純度、反應體積、酶用量等手段仍然無法排除缺陷的，屬 于疑難樣品的DNA。
[0009] 可選的，所述待測生物為海洋生物，特別優選的，所述海洋生物為海帶或貝類。本 發明對于海帶和貝類的具體種類沒有特別的限制，包括所有已知和未知海帶和貝類種類。
[0010] 可選的，所述待測生物為石惱。
[0011] 石惱巧中含有多糖、蛋白質、醋類等雜質物質的干擾，多糖與DNA或者RNA的理化性 質相似，抽提過程中易與DNA形成膠狀沉淀，導致最終提取的DNA純度不高。而運些雜質會對 建庫過程中酶造成影響。本發明所提供的方法能夠去除石惱巧中的雜質物質的干擾，獲得 高質量的測序文庫。
[0012] 其中，在步驟（1)中，進行片段化處理的方式包括但不限于超聲波破碎、酶切破碎 和微波破碎。
[0013] 其中，在所述DNA片段化物料中，DNA片段的大小為180-6(K)bp。
[0014] 優選的，在步驟(2)中，所述瓊脂糖凝膠電泳的凝膠的濃度為2.0%。可選的，凝膠 長度為6cm-12cm。電泳條件為110V，60min或120min(可W根據凝膠長度選擇適當的電泳條 件和時間）。
[0015] 其中，在步驟(2)中，若文庫目的大小的片段為3(K)bp，那么應該切取3(K)bp至34化P 或360bp范圍內的凝膠。優選切取所述電泳膠塊中文庫目的大小的片段至比所述文庫目的 大小的片段大50bp的片段范圍內的凝膠，即如果目的大小的片段為300bp，那么應該切取， 300bp至35化P范圍內的凝膠。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所使用的DNA膠回收試劑盒為QIAGEN公司QIAquick Gel Extraction Kit，最終回溶體積為30-60μ1，本方法建議回溶體積為55.5-60μ1，W便后 續實驗不需要補出0。
[0017] 其中，在步驟(3)中對于進行末端修復、3'端加 Α、加接頭等建庫步驟的試劑來源、 形式沒有特別的要求，但試劑必須能夠完成所述功能。
[0018] 由于片段后物料經過切膠后，符合目的要求的DNA占總量的1/10左右，為保持最適 的接頭與DNA的比例，因此本發明中所使用的接頭的用量顯著低于本領域加接頭時所使用 的接頭用量，可W約為本領域常規接頭用量的1/5-1/10,在本發明的一種實施方式中可W 按照常規推薦用量的十分之一添加接頭，例如，當所使用的接頭為南京諾唯贊公司 (Vazyme)提供的VAHTS DNA Adapters setl/set2for：Qlu苗ilia?試劑盒（Ν801/Ν802)中提 供的接頭時，接頭使用量可W調整為建議用量的1/10,即建議用量為2.化1，在本發明中可 W將其稀釋10倍后，使用2.化1。
[0019] 優選的，在獲得所述連接產物后，還包括利用純化磁珠對所述連接產物進行第二 次純化獲得第二次純化后的連接產物，所述純化珠子的用量為所述連接產物體積的1.0-2.0倍，優選為1.8倍。
[0020] 所述方法還包括對所述第二次純化后的連接產物進行Solexa PCR獲得PCR產物， 再對所述PCR產物進行第二次凝膠電泳并切膠回收獲得文庫DNA。其中，第二次凝膠電泳和 切膠回收的目的是去除非目的DNA、進一步提高文庫片段的均一性，所使用的凝膠濃度優選 為2.0%，切膠范圍為電泳亮帶。
[0021] 本發明還提供了所述DNA高通量測序建庫方法的應用，所述應用包括對存在于含 有多糖、酪類物質、祗類和醋類雜質中的至少一種的環境下的生物進行DNA高通量測序建 庫。
[0022] 本發明所提供的建庫方法適用于復雜環境中生物DNA的高通量測序建庫，具有W 下優點及有益效果：
[0023] (1)能夠有效低降低樣品雜質對建庫酶活反應的抑制效應，解決高通量測序中部 分樣品建庫困難的問題，提高建庫成功率。
[0024] (2)該方法提供的DM片段化后切膠回收，其方法簡單，幾乎所有實驗室均有條件 實現。
[0025] (3)該方法對DNA破碎方法、建庫試劑、建庫流程等簡便易行，可W在多種建庫條件 下使用，適用性廣泛。
【附圖說明】
[0026] 圖1為海帶DNA樣品利用常規高通量建庫方法文庫結果電泳圖。
[0027] 圖2為海帶DNA樣品利用本發明高通量建庫方法文庫結果電泳圖。
[0028] 圖3為貝類DNA樣品利用常規高通量建庫方法文庫結果電泳圖。
[0029] 圖4為貝類DNA樣品利用本發明高通量建庫方法文庫結果電泳圖。
【具體實施方式】
[0030] W下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0031] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段； 實施例中所用的試劑為市售商品。超聲波清洗儀由江蘇蘇美電器公司生產，型號為KQ-50E; 瓊脂糖為Bio-Rad Laboratories, Inc 提供的Ce;rtified? Low Range 叫 1:ra Aga;rose(# 161-3107);膠回收試劑盒為QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit(28706)和 Mi址lute PCR化rification Kit(28006)，建庫試劑由南京諾唯贊公司（Vazyme)提供的 VAHTS? Turbo DNA Libra巧 Pr邱 Kit forTihmiin。? (#ND102)和VAHTS DNA Adapters setl/set2fo;r川川打ilM?試劑盒(N801/N802)，純化磁珠使用的是Beckman Coulter公司的 AMPure XP Beads(A63882)，DNA Marker買自New England Lab(肥B)公司的50bp DNA Ladder(N3236L)。
[0032] 實施例1本發明的高通量測序建庫方法及其與常規高通量建庫方法之間的比較
[0033] -、常規高通量建庫方法實驗步驟及結果：
[0034] 1.取出海帶DNA樣品5(K)ng(北京百邁客生物科技有限公司海帶DNA樣品，編號451， 文庫目的大小的片段為3(K)bp)，加入到PCR管中，補此0至總體積44μ1，置于超聲波清洗儀中 進行DNA破碎至所需片段大小(300-400bp);
[00:35] 2.根據Beckman Coulter公司AM化re XP Beads說明書，使用1.8倍樣品體積的 AMPure XP Beads對片段化DNA進行純化，純化后DNA用55.5μ1出0溶解；
[0036] 3.根據南京諾唯贊公司（Vazyme)提供的VAHTS? Turbo DNA Libraiy Prep Kit forTllTimina @和乂4冊8 DNA Adapters setl/set2 for 1化町山城?試劑盒對片段化且純化 后的DNA進行末端修復、3'末端加 A、連接適用于111皿ina測序平臺的接頭；
[0037] 4.連接產物使用1.8倍樣品體積的AMPure XP Beads進行純化，最后溶劑體積為30 μ1；
[003引 5.純化產物點樣于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳條件110V，120min;切取 "400bp下-400bp上"范圍內凝膠，并用QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit試 劑盒進行回溶，回溶體積30μ1;
[0039] 6.取出連接產物切膠后的12μ1樣品，利用VAHTS? Turbo DNA Library Prep Kit for.Illum.iim @試劑盒提供的高保真化0酶進行Solexa PCR，添加特定Index;
[0040] 7 . Solexa PCR產物點樣于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳條件110V，120min; 電泳完畢的凝膠進行染色、成像，觀察樣品亮度，結果如圖1所示，圖中所使用樣品為北京百 邁客生物科技有限公司海帶DNA樣品451，Marker為化wEnglandLab(肥B)公司50bpDNA Ladder，最亮的條帶為50化P。圖中顯示R3-R7共5個文庫濃度弱，不可見。
[0041 ] 8.切取"400bp-450bp"上范圍內凝膠，使用QIAGEN公司提供的MinElute PCR 化rific