一種豬病毒性腹瀉病毒5重rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測試劑盒及這種檢測試劑盒在非疾病檢測的使用方法，確切講本發明是一種用于豬病毒性腹瀉病毒5重RT-PCR檢測試劑盒及相應的使用方法，所述的5重豬病毒性腹瀉病毒是指:豬流行性腹瀉病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬輪狀病毒，豬札幌病毒和豬嵴病毒。
【背景技術】
[0002]豬病毒性腹瀉是嚴重危害養豬業的重要傳染病之一，造成豬病毒性腹瀉的最主要病原有豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(RV)等。近年來，札幌病毒、嵴病毒以及諾如病毒等也分別在腹瀉豬及健康豬群中分別檢測到。這些病毒是引起豬群或豬場發生病毒性腹瀉主要病原，危害重大，每年對養豬業造成極大的經濟損失。除此之外，上述幾種病毒引起的病毒性腹瀉的臨床癥狀、病理變化、流行特點極其相似，僅憑臨床診斷很難進行鑒別診斷，因而常導致誤診，因此該病的防控及其早期診斷及鑒別診斷顯得尤為重要。然而，腹瀉病的病因復雜以及現有診斷方法的局限性，導致基層獸醫和養殖場對腹瀉病的確診很困難，使腹瀉病的防控不能做到有的放矢、對癥下藥。導致該現象發生的最根本原因是現在缺少可應用的快速、準確、方便的商品化診斷試劑盒。長期以來針對豬病毒性腹瀉的檢測試劑盒主要是以傳統的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬輪狀病毒(RV)的血清學檢測方法為主，然而，近年來豬病毒性腹瀉疫情發生了兩個重大變化:第一，主要引起哺乳仔豬發病、死亡，而哺乳仔豬免疫系統尚未發育健全，未能有效產生血清抗體;第二，在近年來的豬病毒性腹瀉疫情中，豬札幌病毒和嵴病毒等新型病毒時有存在，針對于此兩種病毒目前尚未有成熟的檢測方法。由此可見，現有的檢測豬病毒性腹瀉的檢測試劑盒并不能滿足目前疫病診斷的需求，因此急需研制符合當前疫情流行趨勢的商品化檢測試劑盒，且目前沒有可以一次性檢測、診斷和鑒別診斷上述5種病原的PCR商品化試劑盒。
【發明內容】
[0003]本發明的技術任務在于提供一種可克服現有不足的，具有特異、敏感、快速、使用方便、廉價的用于檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬嵴病毒的5重RT-PCR檢測試劑盒，同時提供這一試劑盒在豬病毒性腹瀉診斷檢測中的使用方法。
[0004]本發明的一種豬病毒性腹瀉病毒5重RT-PCR檢測試劑盒內包括有SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10的十條引物。其中這些特異性引物分別為:
SEQ ID N0.1(KF):ggcattgacatgaatcaggc, SEQ ID N0.2(KR):gcgatcgtaggtcttcgg;SEQ ID N0.3(TF):gggccaacgtaaagagcttcc,SEQ ID N0.4(TR):
gctctgacctttctgcag；SEQ ID N0.5(PF ):taggactcgtactgagggtgt，SEQ ID N0.6( PR ):
ctattttcgcccttgggaatt；
SEQ ID N0.7(RF):gtatggtattgaatatacc?SEQ ID N0.8(RR):tagactgatccagttggc；SEQ ID N0.9(SF):tacagcaagtgggac，SEQ ID N0.lO(SR):atgacactggtgaacggcat〇
[0005]為方便使用，本發明的一種豬病毒性腹瀉病毒5重RT-PCR檢測試劑盒內還包括:A.六堿基隨機反轉錄引物;B.反轉錄預混體系;C.PCR擴增預混體系;D.陽性cDNA對照;E.陰性cDNA對照，所述的反轉錄預混體系包括有:預混的反轉錄緩沖液、dNTP、RNA酶抑制劑、反轉錄酶和DEPC水，PCR擴增體系包括有:PCR緩沖液、上述10條引物混合物、dNTP、Taq酶、雙蒸水。
[0006]本發明的5重RT-PCR檢測試劑盒檢測用于豬病毒性腹瀉病毒的非疾病檢測的使用方法是:先從待檢豬的待檢樣品中通過Trizol法或RNA提取試劑盒提取RNA，利用本發明的試劑盒內的六堿基隨機反轉錄引物(A)和反轉錄預混體系(B)反轉錄為cDNA，以所得到的待檢cDNA為模板，用試劑盒內的PCR擴增預混體系(C)進行擴增，根據所擴增的PCR片段大小不同來判定待檢樣品是否感染一種病原，或是混合感染豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒或/和豬嵴病毒。具體操作時根據擴增產物的核酸電泳圖中是否出現特定條帶，參照陽性(D)和陰性(E)對照以及DNA分子量標準確定待檢豬樣品是否感染豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒或/和豬嵴病毒。
[0007]本發明的試劑盒最佳的使用方法中，PCR擴增預混體系中各引物終濃度為:SEQ IDN0.l和SEQIDN0.2各為0.2pmol/μL;SEQIDN0.3和SEQIDN0.4各為0.05pmol/μL;SEQIDN0.5和SEQIDN0.6各為0.3pmol/μL;SEQIDN0.7和SEQIDN0.8各為l.6pmol/μL;SEQIDN0.9和SEQIDN0.10各為0.2pmol/μL，反應體系為:EcoTaql2.5μL，cDNA5μL，引物混合物7.5仙，(1(1!120補平至總體系25μΜ反應條件為:94°C 4min;94°C 45s，52°C 45s，72°C lmin，35個循環；72°C延伸10min;16°C保存；對各引物所擴增的片段長度為:SEQ IDN0.1 和SEQ ID N0.2的長998bp;SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4長為820bp;SEQ ID N0.5和SEQID N0.6長為600bp; SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8長為350bp; SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10長為194bp。
[0008]利用本發明檢測試劑盒可對同時豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬嵴病毒檢測，其優點在于:根據病原的保守基因的高度保守區設計特異性引物，利用不同病原的特異性引物所擴增的片段大小不同，實現對引起豬病毒性腹瀉病因的檢測。根據擴增片段長度的差異可以準確的判定引起豬病毒性腹瀉的病原，快速確診是單一病原感染引起或是混合感染造成，該方法方便快捷，不僅能為對癥治療提供依據，還可為豬病毒性腹瀉的流行病學調查提供可靠的信息。
[0009]本研究發明試劑盒中的引物是根據引起豬消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守區設計特異性引物，并采用不同病原PCR擴增產物長度不同的策略，建立了檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬嵴病毒的5重RT-PCR檢測方法，為及時治療和防控疫情提供最直接的依據，為養豬業的健康發展保駕護航。
【附圖說明】
[〇〇1〇]圖1:豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬嵴病毒單一引物擴增結果；
圖2:豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬札幌病毒和豬嵴病毒5重RT-PCR最佳反應條件擴增結果；
圖3:豬腹瀉病毒5重RT-PCR檢測方法特異性檢測結果；
圖4:豬腹瀉病毒5重RT-PCR檢測方法單一引物敏感性檢測結果；
圖5:豬腹瀉病毒5重RT-PCR檢測方法5重混合引物敏感性檢測結果；
圖6:豬腹瀉病毒5重RT-PCR檢測方法批間重復檢測結果；
圖7:豬腹瀉病毒5重RT-PCR檢測方法批內重復檢測結果。
【具體實施方式】
[0011]以下結合具體實例和【附圖說明】對本發明做進一步說明
本發明的豬病毒性腹瀉病毒5重RT-PCR檢測試劑盒的使用方法是先將待檢豬的待檢樣品通過Trizol法或RNA提取試劑盒提取RNA，利用本發明的試劑盒內取5tiL提取的總RNA與2μL六堿基隨機反轉錄引物(A)混合后于70°C水浴鍋中孵育