幽門螺桿菌耐藥和定量多重基因檢測體系及其試劑盒和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種多重基因檢測產品W及該產品所用到的檢測體系，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 幽口螺桿菌(H.p^ori)是一種革蘭陰性、微需氧、彎曲狀桿菌，主要寄居在人體胃 部。幽口螺桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋己組織淋己瘤和胃癌等 發生發展密切相關，因此引起臨床的廣泛關注。1994年，國際癌癥研究機構IARC已將其列為 人類I類致癌因子，是目前為止唯一被列為明確對人類致癌的細菌性病原微生物。很多報告 認為幽口螺桿菌感染與冠屯、病、類風濕、肝膽病、肺結核、妊娠嘔吐、直結腸癌及多種皮膚病 等疾病有關。流行病學顯示，全球幾乎有一半的人口感染此菌，發展中國家甚至高達60%~ 70%。因此，幽口螺桿菌感染是世界各國需要面對的公共衛生問題。
[0003] 幽口螺桿菌的療效與其耐藥性和感染量密切相關。幽口螺桿菌臨床治療的常規藥 物包括克拉霉素、甲硝挫、阿莫西林和左氧氣沙星。但是其耐藥現象日益嚴重并呈全球性， 極大地影響了臨床療效。
[0004] 目前幽口螺桿菌的藥敏和定量檢測方法均有其局限性。例如：1)分離培養鑒定:幽 口螺桿菌培養成菌落后，經生化反應鑒定。由于幽口螺桿菌培養需要微需氧條件，對營養條 件要求苛刻，因此檢出率很低，作為常規診斷手段不易推廣，且幽口螺桿菌培養需要一定 的時間，不利于快速診斷。2)組織病理切片染色法:該方法是把患者胃鏡檢查活檢組織切 片，染色后可觀察到組織中的幽口螺桿菌。該方法受幽口螺桿菌載量影響明顯，且操作繁 瑣、費時，不適于大通量樣本的檢測。3)尿素酶依賴性試驗(尿素呼氣試驗）:根據標志物不 同分為1?呼吸試驗及1化呼吸試驗，臨床應用廣泛，。缺點是費用高、易受抑菌藥物和抑酸藥 物的影響、敏感度低。4)免疫學檢查:檢測血清中或唾液和尿液中抗體（IgG)或直接檢測糞 便中幽口螺桿菌的抗原成分。其缺點是不能反映現癥感染。5)定量分析:常用定量分析方法 的是real-time PCR，但該方法檢測單一、通量小、對多個基因分析時成本高。6)藥敏試驗： 該方法耗時長，操作繁瑣，且依賴于分離培養菌株。
[000引綜上所述，如何快速、準確、全面地對幽口螺桿菌進行鑒定、耐藥W及定量分析是 本領域的技術人員迫切亟待解決的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種可W快速、全面、準確、低成本的幽口螺桿菌 耐藥和定量多重基因檢測體系及其試劑盒，W及采用該檢測體系在制備診斷產品方面的應 用。
[0007] 本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是:一種幽口螺桿菌耐藥和定量 多重基因檢測體系，可在同一個反應體系中進行其菌種鑒定、定量、毒力和耐藥性分析。包 括對菌種鑒定基因16S rRNA進行檢測的引物，分別對毒力基因 cagA、vacA-sl、vacA-s2、 vacA-ml、vacA-m2、iceAl、iceA2、d叫A、oipA和luxS進行檢測的引物，分別對耐藥基因23S rRNA的2143位點、rdxA的148位點、pbplA的1777位點和gyrA的261位點的進行多態性檢測的 引物，W及分別對幽口螺桿菌的拷貝數進行定量分析的基因 ureC和β-globin進行檢測的引 物;所述各引物的正向引物的5'端均設有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5' 端均設有反向通用引物序列。所述檢測體系進行PCR反應后進行毛細管電泳分析。
[000引針對16S rRNA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.l所示，針對16S rRNA 基因的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示； 針對cagA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.3所示，針對。日邑4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.4所示； 針對￥日。4-31或￥日。4-32基因的正向引物的核巧酸序列如56010齡.5所示，針對￥日。八- 31或￥曰04-32基因的反向引物的核巧酸序列如56010齡.6所示； 針對vacA-ml基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.7所示，針對￥日。4-1111基因的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.8所示； 針對vacA-m2基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.9所示，針對￥日。4-1112基因的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 10所示； 針對iceAl基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.11所示，針對^641基因的反向 引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 12所示； 針對iceA2基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.13所示，針對^642基因的反向 引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 14所示； 針對dupA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.15所示，針對(1啡4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No. 16所示； 針對oipA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.17所示，針對01口4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No. 18所示； 針對luxS基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.19所示，針對111技基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.20所示； 針對23SrRNA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQIDNo.21所示，對應23SrRNA基因 2143位點為堿基A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.22所示，對應23S rRNA基因2143 位點為堿基G的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 23所示； 針對rdxA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.24所示，對應rdxA基因148位點 為堿基C的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.25所示，對應rdxA基因148位點為堿基T的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 26所示； 針對pbplA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.27所示，對應口6口心基因1777位 點為堿基A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 28所示，對應pbplA基因1777位點為堿基 G的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 29所示； 針對gyrA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.30所示，對應gyrA基因261位點 為堿基C或T的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 31所示，對應gyrA基因261位點為堿基G 或A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 32所示； 針對ureC基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.33所示，針對山"6(：基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.34所示； 針對β-g 1 obiη基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 35所示，w及針對β-g 1 ob iη 基因的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 36所示； 所述正向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No.37所示； 所述反向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0009]針對 16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s 1、vacA-ml、vacA-m2、iceAl、iceA2、dupA、οipA 和luxS基因的正向引物在檢測體系中的終濃度均為200nM;針對16S rRNA、ureC、cagA、 vacA-sl、vacA-ml、vacA-m2、iceAl、;[。642、01口4、111技、和6-邑1013；[]1基因的反向引物在檢測 體系中的終濃度均為10化Μ;針對dupA和β-globin基因的正向引物在檢測體系中的終濃度 均為lOOnM; 針對23S rRNA基因的2143位點、rdxA基因的148位點、pbp 1A基因的1777位點和gyrA基 因的261位點的正向引物在檢測體系中的終濃度均為10化Μ;對應23S rRNA基因2143位點為 堿基A的反向引物在檢測體系中的終濃度均為300nM;對應23S rRNA基因2143位點為堿基G 的反向引物在檢測體系中的終濃度均為35化M;對應rdxA基因148位點為堿基C、對應pbplA 基因1777位點為堿基A、對應gyrA基因261位點為堿基C或T的反向引物、對應rdxA基因148位 點為堿基T、對應pbp 1A基因1777位點為堿基G的反向引物在檢測體系中的終濃度均為 400nM;對應gyrA基因261位點為堿基G或A的反向引物在檢測體系中的終濃度均為450nM。 [00 10] 上述幽口螺桿菌檢測體系還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs、熱啟動DM聚合 酶、帶巧光的通用標簽混合物和DNA模板;所述帶巧光的通用標簽混合物中包括反向通用引 物和帶有巧光標記的正向通用引物。
[00川上述巧光標記為CY5、CY3或FAM等。
[001引上述幽口螺桿菌檢測體系還包括陽性對照液和陰性對照液;所述陽性對照物是包 括所有目的基因祀點的質粒混合物;所述陰性對照液是無核酸酶超純水。
[0013] 上述幽口螺桿菌檢測體系反應時體系中的組分用量為10X的PCR緩沖液1體積，帶 巧光的通用標簽混合物和2mmol/L的dNTPs共1體積，25mmol/L的MgCb溶液2體積，引物混合 物1體積，抓/μL的熱啟動DNA聚合酶1體積，DNA模板2體積，純水2體積。
[0014] 上述DNA模板的使用量為5~50ng/體系。
[0015] 本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是:一種采用上述檢測體系制 備幽口螺桿菌檢測和診斷產品的應用。
[0016] 本發明為解決上述技術問題提出的又一種技術方案是:一種采用上述檢測體系的 幽口螺桿菌耐藥和定量多重基因檢測試劑盒。
[0017] 本發明具有