檢測人aeg-1基因表達量和相對表達量的引物對的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域中檢測人AEG-1基因表達量和相對表達量的引物對。
【背景技術】
[0002] 肝癌是病死率很高的消化系統腫瘤，其中9 0 %為肝細胞肝癌 化epatocellula;rca;rcinoma，HCC)。在世界范圍內，其發病率呈現上升的趨勢。我國是肝癌 大國，也是全球肝癌發病率最高的國家。據統計，目前我國肝癌發病人數占全球的55%，而 死亡人數約占全世界肝癌死亡人數的45%，素有"癌中之王"的稱號，對我國人民健康構成 嚴重威脅。目前臨床上主要使用AFP作為肝癌診斷的標志物，但是由于肝炎、肝硬化等影響 很容易造成誤診。因此，尋找新的肝癌診斷標志物至關重要。
[0003] 星形細胞上調基因-1 (astro巧te elevated gene-1，AEG-1)是近期發現的新型促 癌基因。AEG-1基因編碼人類AEG-1蛋白，是含有582個氨基酸，分子量為64kd的蛋白。它是 RAS，C-MYC基因的下游，其過度表達可W導致下游PI3K/AKT激活NF-κΒ和WNT信號通路。AEG-1被確定參與調控腫瘤轉移過程，并且其表達水平在大多數腫瘤組織偏高，主要包括結腸 癌，卵巢癌，乳腺癌，肝癌等。尤其在肝癌當中，與癌旁組織相比，AEG-1的表達明顯升高。因 此，AEG-1有希望成為潛在的肝癌診斷標志物。
【發明內容】
[0004 ]本發明所要解決的技術問題是如何檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量。
[000引為解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或 相對表達量的引物對。
[0006] 本發明所提供的檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量的引物對，為 名稱為AEG-1-P的由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測人類AEG-1基因表達量或 相對表達量的成套試劑。
[0008] 本發明所提供的檢測或輔助檢測人類AEG-1基因表達量或相對表達量的成套試 劑，由所述AEG-1-P與名稱為GAPDH-P的與人的GAPDH基因特異結合的引物對組成。
[0009] 上述成套試劑中，所述GAP畑-P由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單 鏈DNA組成。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相 對表達量的試劑或試劑盒。
[0011] 本發明所提供的檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量的試劑或試劑 盒，由所述AEG-1-P或所述成套試劑與XI組成，所述XI為進行定量PCR擴增所需試劑。
[0012] 上述試劑或試劑盒中，所述進行定量PCR擴增所需試劑可為qPCR MIXdqPCR MIX可 為北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司產品。
[0013] 上述試劑或試劑盒中，所述定量PCR擴增可為實時巧光定量PCR擴增。
[0014] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相 對表達量的系統。
[0015] 本發明所提供的檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量的系統，由所 述AEG-1-P、所述成套試劑或所述試劑或試劑盒與Y1組成，所述Y1為進行RNA提取所需的試 劑、進行反轉錄所需的試劑和/或進行定量PCR擴增所需儀器。
[0016] 上述系統中，所述進行RNA提取所需的試劑可為TRIzol、氯仿、異丙醇和/或乙醇。 TRIzol可為上海捷瑞生物工程有限公司產品。
[0017] 所述進行反轉錄所需的試劑可為ReveWranscript qPCR RT Kit中的試劑。 ReverTranscript qPCR RT Kit為Takara公司產品。
[0018] 所述進行定量PCR擴增所需儀器可為實時巧光定量per儀（如AB 口 300或AB 口 500 (美國Applied Biosystems公司））。
[0019] 為解決上述技術問題，本發明還提供了鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞的系 統。
[0020] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞的系統，包括所述AEG-1-P、 所述成套試劑、所述試劑或試劑盒或所述檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達 量的系統與基因定量數據處理系統;所述基因定量數據處理系統用于計算將來自待鑒定組 織和/或細胞的AEG-1基因的表達量或相對表達量，根據所述待鑒定組織和/或細胞的AEG-1 基因的表達量或相對表達量確定待鑒定組織和/或細胞是否為腫瘤組織和/或細胞。
[0021] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測AEG-1基因的表達量或相對表達量的 方法。
[0022] 本發明所提供的檢測AEG-1基因的表達量或相對表達量的方法，包括W離體的待 鑒定組織和/或細胞的cDNA或RNA為模板，用所述AEG-1-P進行PCR擴增，所述PCR擴增中的退 火條件可為58°C35sec。反應條件具體可為:95°C預變性Imin; 95°C 15s，58°C35sec，40個循 環。
[0023] 所述PCR擴增時的反應體系可為25化反應體系，具體如下：2化cDNA溶液，12.化L qPCR Mix(2X)，AEG-1-F(AEG-1-F在該反應體系中的濃度為0.2μM)，AEG-1-R(AEG-1-R在該 反應體系中的濃度為0.2μΜ)，用無菌蒸饋水補至2如L。
[0024] 為解決上述技術問題，本發明還提供了鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞的方 法。
[0025] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞的方法，包括:檢測來自待鑒 定組織和/或細胞的AEG-1基因的表達量或相對表達量；如果所述待鑒定組織和/或細胞的 AEG-1基因的表達量或相對表達量越高，所述待鑒定組織和/或細胞為或候選為腫瘤組織 和/或細胞的風險越大，如果所述待鑒定組織和/或細胞的AEG-1基因的表達量或相對表達 量越低，所述待鑒定組織和/或細胞為或候選為腫瘤組織和/或細胞的風險越小。
[0026] 上述方法中，所述待鑒定組織和/或細胞可為肝臟組織和/或肝臟細胞。
[0027] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述AEG-1-P、所述成套試劑、所述試劑或 試劑盒或所述系統在下述1 )-5)中任一種中的應用：
[0028] 1)檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量；
[0029] 2)制備檢測或輔助檢測人AEG-1基因表達量或相對表達量產品；
[0030] 3)鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞；
[0031] 4)制備鑒定或輔助鑒定腫瘤組織和/或細胞產品。
[0032] 上述應用中，所述腫瘤組織和/或細胞可為肝癌、結腸癌、卵巢癌或乳腺癌組織和/ 或細胞。
[0033] 實驗證明，本發明的引物對能夠檢測AEG-1在肝癌組織中的表達含量，操作相對簡 單，結果準確。
[0034] 本發明鑒于現有技術中檢測肝癌樣品標志物的不足，本發明設計了檢測內參/目 的基因用引物，用巧光定量PCR技術檢測人融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物 探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用于檢測AEG-1基因相對表 達量的試劑盒。
[003引使用本發明的試劑盒，將實時巧光PCR技術對AEG-1基因的表達水平進行檢測，檢 測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。采用雙標準曲線法，通過構建 AEG-1和內參基因 GAPDH的標準定量曲線，精確定量樣本的內參基因拷貝數和AEG-1拷貝數， 相比于W往的免疫組化方法，該試劑盒具有精度高，結果便于判讀等優點。加之該試劑盒將 反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的 條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該試劑盒經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助 于臨床樣品的輔助性檢測。
【附圖說明】
[0036] 圖1為AEG-1烙解曲線。
[0037] 圖2為GAPDH烙解曲線。
[003引圖3為AEG-1和GAPDH的擴增曲線。其中。左側為GAPDH擴增曲線，右側為AEG-1擴增 曲線。
[0039] 圖4為8位臨床肝癌患者AEG-1的相對表達量。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0041 ]下述實施例中的實驗方法，如