復合菌法提取劍麻皂素和/或海柯吉寧的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫藥原料生產領域，具體設及提取劍麻皂素和/或海柯吉寧的方法。
【背景技術】
[0002] 劍麻，又稱渡蘿麻、西紗爾麻、龍舌蘭麻，是龍舌蘭科龍舌蘭屬植物。據統計，2010 年末我國劍麻種植面積2.05萬公頃，收獲面積1.83萬公頃，總產纖維4.63萬噸。劍麻中干纖 維重量占全株6%左右，其他90% W上是葉汁、葉渣、麻莖、花軸。目前劍麻最主要的用途是 抽取劍麻纖維，在加工過程中會產生的大量麻渣，成為廢棄物不僅造成資源浪費，而且會造 成環境污染。為了解決此問題，國內的科學研究者做了大量工作，包括從麻渣中提取劍麻皂 素(又稱替告吉寧，替告皂武元)和海柯吉寧(又稱海柯皂武元，番麻皂素）。
[0003] 劍麻皂素和海柯吉寧(具體結構分別如下式所示)都含有醬體骨架成分，是半合成 醬體藥物的重要原料。劍麻皂素主要用于合成哺乳動物性信息素雄醬締酬和雄醬締醇，皮 質激素氨化可的松、地塞米松及倍他米松，蛋白同化激素、抗屯、律失常藥、抗腫瘤藥環硫雄 醇，口服避孕藥雙烘失碳醋，骨骼肌松弛藥贓庫漠錠等醬體藥物。
[0004]
[0005] 龍舌蘭屬植物中均含有醬體皂巧元，只是含量多少不同，均可用于提取劍麻皂素 和海柯吉寧。中國專利CN1280305C公開了從劍麻或番麻中提取劍麻皂素或番麻皂素，具體 公開了將劍麻或番麻粉碎后加入水和發酵酶制劑常溫發酵后，用強酸和有機溶劑或強堿和 有機溶劑水解皂巧，酒精多次重結晶后得到劍麻皂素或番麻皂素。該方法由于用到了強酸 和強堿，不僅對設備耐酸堿要求高，而且對環境有較大污染，另外，還用到了毒性較大的有 機溶劑例如二甲苯等。中國專利申請CN103834713A利用絲狀真菌發酵產生的粗酶液水解皂 巧，用氯仿或正下醇提取劍麻皂素，該方法雖然提取條件溫和，對環境污染不大，但因為不 能完全水解皂巧而產生次級巧，導致皂巧降解率低、劍麻皂素回收率低，而且由于海柯吉寧 只在C-12位比劍麻皂素多了一個酬幾基，在提取得到的劍麻皂素中，不可避免地含有海柯 吉寧，因此，不能得到純度較高的劍麻皂素。
【發明內容】
[0006] 為了解決現有的提取劍麻皂素和海柯吉寧的方法所存在的產品收率和純度低，需 要用到強酸、強堿或者有機溶劑不僅污染環境而且毒性大，工藝復雜，成本高等問題，本發 明提供了一種復合菌法提取劍麻皂素或海柯吉寧的方法。
[0007] 本發明的發明人發現，當將不同的霉菌組合，其在發酵過程中所產生的酶能夠有 效地降解龍舌蘭屬植物麻渣中所含有的醬體皂巧，從而無需使用強酸、強堿或者毒性大的 有機溶劑。本發明的方法提取條件溫和、成本低廉、對環境污染小、操作簡單，而且能夠提高 產品收率和純度，從而使麻渣能夠得到充分利用。
[0008] 本發明具體設及一種復合菌法提取劍麻皂素和/或海柯吉寧的方法，包括如下步 驟：
[0009] (1)取龍舌蘭屬植物或其麻渣，加水，調抑至3-6，加入果膠酶和纖維素酶，攬拌反 應后得到清液1;
[0010] (2)將菌種分別接種于培養液中，發酵結束后，將發酵液與清液1混勻，攬拌反應， 靜置，去除上層清液，將下層離屯、，去除上層清液，得到沉淀物1，收集此步驟所得清液高溫 滅菌后棄去；
[0011] (3)將沉淀物1與生石灰混勻，加入75-95%的乙醇水溶液，加熱回流后，加入活性 炭，回流后，離屯、，棄去沉淀，得到清液2;
[0012] (4)在清液2中加入強堿，攬拌溶解后，加入鹽酸徑胺，加熱回流后，離屯、得清液3和 沉淀物2; W及
[0013] (5)將清液3結晶，干燥得到劍麻皂素;和/或
[0014] (6)將沉淀物2與至少85%的乙醇水溶液和0.5-1.5mol/L的鹽酸水溶液混勻，回流 后，重結晶，干燥得到海柯吉寧。
[0015] 本發明的方法可W使用各種龍舌蘭屬植物或其麻渣來提取劍麻皂素和海柯吉寧， 優選劍麻、番麻、亞洲馬蓋麻、假渡蘿麻、無刺番麻，最優選劍麻。本發明所使用的復合菌優 選為黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)，或者為里氏木霉 (Trichorderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和青霉菌（Penicillium sp.)。
[0016] 本發明所使用的麻渣可W是龍舌蘭屬植物在抽取纖維后未干燥的麻渣，也可W是 干渣，優選干渣。麻渣可W直接使用無需粉碎，也可W在使用前被粉碎。在本發明中，優選龍 舌蘭屬植物或其麻渣被粉碎成粒徑為0. 〇l-5cm的顆粒，更優選粒徑為0.1-3畑1，最優選粒徑 為約1cm。
[0017] 在步驟（1)中，優選加水量為龍舌蘭屬植物或其麻渣重量的0.5-25倍，更優選1-10 倍，最優選2-5倍。本領域技術人員能夠理解，可W使用各種抑調節劑來調節抑，包括但不限 于巧樣酸-氨氧化鋼-鹽酸緩沖溶液、憐酸氨二鋼-巧樣酸緩沖液或巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液 等。一般來說，優選抑被調節至4-5,最優選約4.5。優選龍舌蘭屬植物或其麻渣:果膠酶:纖 維素酶的重量比為1: (0.001-0.2): (0.0005-0.1)，更優選為1: (0.005-0.1): (0.001-0.05)，最優選為1:(0.01-0.02) :(0.005-0.01)。優選反應時間為l-12h，更優選為2-化，最 優選為4-化。
[0018] 本領域技術人員可W理解，各種培養液均可用于本發明，培養液可W商購得到或 者通過本領域已知的方法自制得到。在本發明中，黑曲霉或青霉菌的培養液中含有:馬鈴馨 提取液 1.0L、葡萄糖20.0g、K出P〇43.0g、MgS〇4 · 7出0 1.5g、維生素 BiO.lg、瓊脂 15.0g;米曲 霉培養液中含有:麥芽汁1.化、瓊脂15. Og，調節抑至4.8;里氏木霉培養液含有:馬鈴馨提取 液1.化、葡萄糖20.Og、瓊脂15.Og。優選在上述培養液中，進一步含有質量百分比為0.001-0.1 %的麻汁，進一步優選麻汁的質量百分比為0.005-0.05%，最優選為約0.01 %。優選在 本發明中，黑曲霉或青霉菌的培養液組成為：馬鈴馨提取液1.化、葡萄糖20.0g、K出P043 . Og、 1邑5化《7此01.5旨、維生素810.1旨、瓊脂15.0旨、質量百分比為0.001-0.1%的麻汁;米曲霉培 養液組成為:麥芽汁1.化、瓊脂15. Og、質量百分比為0.001-0.1 % %的麻汁，調節抑至4.8; 里氏木霉培養液組成為：馬鈴馨提取液1.0L、葡萄糖20.0 g、瓊脂15. Og、質量百分比為 0.001-0.1%的麻汁。在上述培養液中，優選麻汁的質量百分比為0.005-0.05%，最優選為 約 0.01 %。
[0019] 在步驟(2)中，優選發酵結束后發酵液中菌量為2-50mg/mL，進一步優選為5-40mg/ mL，更優選為10-30mg/mL，進一步更優選為12-20mg/mL，最優選為約15mg/mL。在使用黑曲霉 和米曲霉的復合菌方案中，優選清液1:黑曲霉發酵液:米曲霉發酵液體積比為1:(0.5-5): (0.5-5)，更優選為1:(0.8-3) :(0.8-3),最優選為1:(1-1.5) :(1-1.5);在使用里氏木霉、米 曲霉和青霉菌的復合菌方案中，優選清液1:里氏木霉發酵液:米曲霉發酵液:青霉菌發酵液 體積比為 1:(0.5-5) :(0.5-5) :(0.1-3),更優選為 1:(0.8-3) :(0.8-3) :(0.3-1.5)，最優選 為1: (1-1.5): (1-1.5): (0.5-1)。反應溫度優選為20-60°C，更優選為30-40°C，最優選為32-37°C。反應時間優選為0.5-5天，更優選為1-3天，最優選為約2天。優選靜置2-72h，更優選 24-60h，最優選約48h。優選離屯、轉速為2000-8000轉/min，更優選為3000-6000轉/min，最優 選為 3500-4500轉/min。
[0020] 在步驟(3)中，優選沉淀物1:生石灰：活性炭：乙醇水溶液的重量比為1:(0.075-0.5) :(0.05-0.3) :(5-15),更優選為 1:(0.1-0.3) :(0.075-0.2) :(6-12),最優選為 1:0.2: 0.15: (8-10)。優選乙醇水溶液的濃度為80-90%，最優選為約85%。優選加入生石灰后的回 流時間為1-lOh，更優選為2-化，最優選為約4h;回流溫度為70-90°C，更優選為75-85°C，最 優選為約79°C。優選加入活性炭后的回流時間為0.5-化，更優選為1-化，最優選為約化。優 選離屯、轉速為2000-8000轉/min，更優選為3000-6000轉/min，最優選為3500-4500轉/min。
[0021] 在步驟(4)中，優選強堿為氨氧化鋼或氨氧化鐘。優選沉淀物1:鹽酸徑胺:強堿的 重量比為 1:(0.1-0.5) :(0.25-1.25)，更優選為 1:(0.15-0.3) :(0.3-0.8)，最優選為約 1: 0.2:0.5。優選回流時間為2-1511，更優選為4-10}1，最優選為6-化。優選回流溫度為70-90°(3， 更優選為75-85°C，最優選為約79°C。優選離屯、轉速為2000-8000轉/min，更優選為3000-6000轉/min，最優選為 3500-4500轉/min。
[0022] 在步驟(6)中，優選沉淀物2:乙醇水溶液:鹽酸水溶液的重量比為1:(2-15) :(0.2-5)，更優選為1: (3-10): (0.5-2)，最優選為1:巧-8): (1-1.6)。優選乙醇水溶液的濃度為90-98%，最優選為約95%。優選鹽酸水溶液的濃度為0.8-1.2111〇1/1，最優選為約1111〇1/1。優選 回流時間為1 -12h，更優選為2-化，最優選為4-化。
[0023] 本領域技術人員能夠理解，在步驟(5)和(6)中，可W使用各種本領域已知的結晶 或重結晶方法。例如:在步驟(5)中，可W將清液3調抑至中性，濃縮，冷卻靜置直至劍麻皂素 結晶不再析出，離屯、，將沉淀用水洗后干燥即得劍麻皂素，其中，優選用Imol/L的HC1水溶液 調抑;在步驟(6)中，將回流后的溶液調pH至6.5-7.0,蒸饋回收溶劑，將所得固體用熱丙酬 溶解，冷卻靜置直至海柯吉寧結晶不再析出，離屯、，將沉淀