一種從鰻魚骨中提取的鰻魚小分子肽及其提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及到用魚骨提取肽的技術，具體涉及一種從鰻魚骨中提取小分子肽的方法。
【背景技術】
[0003]從動物例如牦牛骨骼中提取的膠原蛋白在吸收率方面有一定的局限性，并且隨著對瘋牛病帶來的風險，使得這種較為傳統的方式不被人們所認可，而人們越來越認可從魚類中提取相應的營養物質。
[0004]目前的提取主要是從魚鱗、魚皮中提取膠原蛋白，例如從羅非魚魚鱗中提取，從深海魚皮例如鱈魚魚皮中提取，但是這些提取物產品分子量分布廣不易吸收，大分子導致的吸收率低等突出問題的存在，極大的阻止了現代人所追求的營養價值高，安全，吸收好等新保健理念的實現。
[0005]另一方面，傳統的膠原蛋白或蛋白肽提取液體積較大，產品的生產周期較長，酶解液除雜不徹底，影響膠原蛋白品質，所得成品往往具有苦腥味，口感差，如果過濾級別不夠的話，產品水溶性就會較差，直接影響消化吸收，對魚類提取物的含鹽量高的問題解決效果不理想，影響產品口感。
[0006]雖然隨著技術進步，人們運用膜分離技術的優勢，在一定程度上提高了產品質量，但是還沒有從根本上得到小分子活性肽。
【發明內容】
[0007]本發明為有效解決上述問題，提供一種全新的制備方法，以鰻魚骨為原料，通過創新手段得到易于吸收，口感好，營養價值高，安全的鰻魚小分子活性肽，且該方法提取效率高，工藝簡單使用。
[0008]本發明采用改良的生物酶解修飾復配法，制備鰻魚小分子活性肽，具體技術方案是，一種從鰻魚骨中提取鰻魚小分子活性肽的方法，包括如下步驟:(I)鰻魚骨處理:將新鮮的鰻魚骨清洗干凈，破碎，在蒸煮罐中，采用溫度為120-150°C的溫度，0.13-0.15Mpa的壓力蒸煮6-10h，骨渣排出，得到骨湯，速凍后，形成冷凍骨湯油凍塊，貯存于_18°C的冷凍庫內備用；(2)低溫粉碎處理:采用粉碎機在低溫對所述的冷凍骨湯油凍塊進行低溫粉碎，粉碎溫度控制在0-4°C之間，將所述的冷凍骨湯油凍塊粉碎為顆粒直徑在0.02-0.1毫米的冷凍骨湯油凍塊顆粒；(3)細胞溶出處理:采用常壓下4°C無氧水對粉碎的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行浸滲水處理，水飽和時間為6-8小時，所述無氧水以完全淹沒原料為準;然后快速深度冷凍與融凍處理，其中深冷凍處理時間為l_2h，冷凍溫度為零下22-25°C，緊接著融凍，即以常壓下4°C水浴對處于深冷凍的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行快速融冰，融冰處理時間為3-5h;重復所述的快速深度冷凍與融凍處理過程2-3次，細胞壁結構被破壞，有效物質溶出，形成鰻魚寡肽骨湯；(4)生物酶解處理:將所述鰻魚寡肽骨湯導入水解罐中，加入復合酶，所述的復合酶制備方法如下，先將草芽孢桿菌、雙歧螺桿菌、鼠李糖乳桿菌、光合菌、地衣芽孢桿菌置于三角瓶中進行培養，培養的溫度為28-33°C，在200-250rpm/min下培養25_35h，使菌體或者孢子濃度達到I X 114個/升(CFU/L)，制得發酵劑，然后向發酵劑中加入營養素，控制營養素的重量是所述發酵劑重量的1/5-1/8，所述的營養素為麥芽汁，即得到所述的復合酶，按照鰻魚寡肽骨湯與復合酶1000-1200:1的重量比加入所述的復合酶進行生物酶解處理，在所述生物酶解過程中保持水解罐中PH為6.8-7.0，所述酶解溫度為60°C，所述酶解時間為13-21°C，得到初級鰻魚小分子活性肽；(5)后處理:將所述的初級鰻魚小分子活性肽滅酶，快速升溫至180-185°C并保持20-25s，然后50-60°C/s降溫至60°C使酶失活;然后采用高速離心機將酶解液以60000-80000r/min的速度離心3-5min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內，即酶解分離液，下層液被分離出去，然后采用熱隔膜低溫濃縮技術進行濃縮，濃縮溫度為45-50°C，真空度為0.4-2.0MPa，將濃縮液輸送到200-220°C的離心噴霧干燥塔內干燥成粉沫，即得到所述的鰻魚小分子活性肽。
[0009]優選，步驟(I)中采用溫度為130°C的溫度，0.14Mpa的壓力蒸煮7h，骨渣排出，得到骨湯，速凍后，形成冷凍骨湯油凍塊，貯存于_18°C的冷凍庫內備用；步驟2)中，粉碎溫度控制在2°C，將所述的冷凍骨湯油凍塊粉碎為顆粒直徑在0.05毫米的冷凍骨湯油凍塊顆粒。
[0010]優選，步驟(3)中細胞溶出處理:采用常壓下4°C無氧水對粉碎的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行浸滲水處理，水飽和時間為7小時，所述無氧水以完全淹沒原料為準;然后快速深度冷凍與融凍處理，其中深冷凍處理時間為2h，冷凍溫度為零下25°C，緊接著融凍，即以常壓下4°C水浴對處于深冷凍的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行快速融冰，融冰處理時間為3h;重復所述的快速深度冷凍與融凍處理過程3次，細胞壁結構被破壞，有效物質溶出，形成鰻魚寡肽骨湯。
[0011]優選，步驟(4)中在三角瓶中進行培養，培養的溫度為30°C，在200rpm/min下培養28h，使菌體或者孢子濃度達到I X 114個/升(CFU/L)，按照鰻魚寡肽骨湯與復合酶1000:1的重量比加入所述的復合酶進行生物酶解處理，在所述生物酶解過程中保持水解罐中PH為7.0，所述酶解溫度為60°C，所述酶解時間為21°C，得到初級鰻魚小分子活性肽。
[0012]優選，步驟(5)中后處理:將所述的初級鰻魚小分子活性肽滅酶，快速升溫至180°C并保持25s，然后60°C/s降溫至60°C使酶失活；然后采用高速離心機將酶解液以60000-70000r/min的速度離心4-5min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內，即酶解分離液，下層液被分離出去，然后采用熱隔膜低溫濃縮技術進行濃縮，濃縮溫度為45°C，真空度為
2.0MPa，將濃縮液輸送到200°C的離心噴霧干燥塔內干燥成粉沫，即得到所述的鰻魚小分子活性肽。更優選高速離心機將酶解液以60000r/min的速度離心4min。
[0013]本發明還提供上述方法制備的所述的鰻魚小分子活性肽，所述的鰻魚小分子肽的分子量為0-480道爾頓的占比不少于88.2%，具體所述的暢魚小分子肽的分子量為0-480道爾頓的占比為88.61 %，480-1000道爾頓的占比為9.43%，大于1000道爾頓的占比為
1.96%，色澤為淡黃色。
[0014]本發明還提供上述述的鰻魚小分子肽的應用;所述的鰻魚小分子肽適用于診斷用肽、肽疫苗、抗菌活性肽、細胞因子模擬肽、抗病毒肽或抗腫瘤肽，以及肽保健品。
[0015]本發明的積極效果:
[0016]首先本發明制備的鰻魚小分子活性多肽成分純，優于現有技術中制備的多肽，本發明制備的暢魚小分子活性多肽含量接近100%，所述的暢魚小分子肽的分子量為0-480道爾頓的占比不少于88.2%，具體所述的鰻魚小分子肽的分子量為0-480道爾頓的占比為88.61%，480-1000道爾頓的占比為9.43%，大于1000道爾頓的占比為1.96%，色澤為淡黃色。
[0017]其次采用生物蛋白酶解技術將鰻魚骨頭原料降解成膠原螺旋肽;采用超微膜和低溫濃縮技術分離鰻魚小分子活性肽，產品具有穩定性、抗氧化性、易保存，易被人體吸收，得到的鰻魚小分子活性肽粉沫既可以沖水可，又可以做出膠囊，使人們在日常生活過程得到保健功效，既有藥用價值，又有營養價值。采用生物技術，綜合使用了細胞溶出處理，生物酶解處理以及分離純化、濃縮成肽生物保健品，為鰻魚骨提供了新的途徑。本發明制備的鰻魚小分子肽，可以應用于肽類藥物和肽類保健品，應用范圍比較廣泛，例如用于診斷用肽、肽疫苗、抗菌活性肽、細胞因子模擬肽、抗病毒肽和/或抗腫瘤肽等。本發明制備的鰻魚小分子肽滿足了日益增長的藥品和保健品的使用需要，可以安全大規模制備使用。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0019]實施例1
[0020]一種從鰻魚骨中提取鰻魚小分子活性肽的方法，包括如下步驟:(I)鰻魚骨處理:將新鮮的鰻魚骨清洗干凈，破碎，在蒸煮罐中，采用溫度為120°C的溫度，0.13Mpa的壓力蒸煮10h，骨渣排出，得到骨湯，速凍后，形成冷凍骨湯油凍塊，貯存于-18°C的冷凍庫內備用；
(2)低溫粉碎處理:采用粉碎機在低溫對所述的冷凍骨湯油凍塊進行低溫粉碎，粉碎溫度控制在4°C，將所述的冷凍骨湯油凍塊粉碎為顆粒直徑在0.02毫米的冷凍骨湯油凍塊顆粒；
(3)細胞溶出處理:采用常壓下4°C無氧水對粉碎的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行浸滲水處理，水飽和時間為8小時，所述無氧水以完全淹沒原料為準;然后快速深度冷凍與融凍處理，其中深冷凍處理時間為2h，冷凍溫度為零下22°C，緊接著融凍，即以常壓下4°C水浴對處于深冷凍的冷凍骨湯油凍塊顆粒進行快速融冰，融冰處理時間為3h;重復所述的快速深度冷凍與融凍處理過程2次，細胞壁結構被破壞，有效物質溶出，形成鰻魚寡肽骨湯；(4)生物酶解處理:將所述鰻魚寡肽骨湯導入水解罐中，加入復合酶，所述的復合酶制備方法如下，先將草芽孢桿菌、雙歧螺桿菌、鼠李糖乳桿菌、光合菌、地衣芽孢桿菌置于三角瓶中進行培養，培養的溫度為33°C，在200rpm/min下培養35h，使菌體或者孢子濃度達到1\1014個/升(0?1]/L)，制得發酵劑，然后向發酵劑中加入營養素，控制營養素的重量是所述發酵劑重量的1/5，所述的營養素為麥芽汁，即得到所述的復合酶，按照鰻魚寡肽骨湯與復合酶1000:1的重量比加入所述的復合酶進行生物酶解處理，在所述生物酶解過程中保持水解罐中PH為7.0，所述酶解溫度為60°C，所述酶解時間為21 °C，得到初級鰻魚小分子活性肽；(5)后處理:將所述的初級鰻魚小分子活性肽滅酶，快速升溫至185°C并保持25s，然后56°C/s降溫至60°C使酶失活;然后采用高速離心機將酶解液以60000r/min的速度離心3min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內，即酶解分離液，下層液被分離出去，然后采用熱隔膜低溫濃縮技術進行濃縮，濃縮溫度為45°C，真空度為2.0MPa，將濃縮液輸送到200°C的離心噴霧干燥塔內干燥成粉沫，即得到所述的鰻魚小分子活性肽。
[0021]實施例2
[0022]一種從鰻魚骨中提取鰻魚小分子活性肽的方法，包括如下步驟:(I)鰻魚骨處理:將新鮮的鰻魚骨清洗干凈，破碎，在蒸煮罐中，采用溫度為120°C的溫度，0.13Mpa的壓力蒸煮10h，骨渣排出，得到骨湯，速凍后，形成冷凍骨湯油凍塊，貯存于-18°C的冷凍庫內備用；
(2)低溫粉碎處理:采用粉