一種發酵生產卷曲霉素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵工程領域，具體設及一種發酵生產卷曲霉素的方法。
【背景技術】
[0002] 結核病死灰復燃，正嚴重威脅人類健康。近年來，耐多藥結核(MDR-TB)的出現，W 及結核分枝桿菌與人類免疫缺陷病毒的聯合感染導致結核病再度在全球成流行趨勢。卷曲 霉素是治療耐多藥結核分枝桿菌和持留菌感染的一類重要藥物。該藥對耐藥型結核桿菌感 染引起的肺結核療效顯著，毒副作用較其他二線藥物小，是目前較理想的抗結核菌藥物。
[0003] 卷曲霉素，是由卷曲鏈霉菌發酵產生的環狀多膚類抗生素，由四個結構相似的活 性化合物IA、IB、IIA、IIB組成，其中IA和IB的含量占 90%W上，是發揮療效的主要成分。IA的 分子式為C25也4化4〇8，分子量為668，IB的分子式為C25也4化4〇7，分子量為652。
[0004] 在卷曲霉素發酵過程中加入前體物質是提高發酵單位的重要手段，通過補加前體 物質，可W達到控制卷曲鏈霉菌的生物合成方向及增加卷曲霉素產量的目的。卷曲霉素是 環狀多膚類抗生素，遵循NRPS(非核糖體膚合成酶)生物合成途徑，其前體物質為特定的氨 基酸。
[000引在卷曲霉素的生物合成途徑中，主要包括非蛋白氨基酸的合成、膚環骨架的生物 合成、成環后結構修飾。卷曲霉素的膚環骨架是由多個經過修飾的非蛋白氨基酸和天然氨 基酸經非核糖體多膚合成酶催化合成的5膚環。成環后氨基酸殘基4位上的β氨基甲酯化，氨 基酸殘基3位上的β賴氨酸酷基化成為重要結構修飾步驟，在氨基酸活化酶和膚縮合酶的作 用下，形成副組分中間體卷曲霉素 ΠΑ、ΠΒ向有效組分ΙΑ、ΙΒ的轉化。從外界補加合成卷曲 霉素的氨基酸前體物質，能明顯地提高卷曲霉素的發酵水平。但是，外源性前體物質在發酵 液中的殘留濃度過高，會使生產菌株中毒，不利于卷曲霉素的生物合成;而前體物質不足也 會大大影響卷曲霉素的生產。因此，研究適當的前體添加策略對卷曲霉素的高產穩產具有 重要的意義。
[0006] 卷曲霉素為微生物發酵的次級代謝產物，存在于發酵液中，卷曲霉素不僅對其他 生物有殺死或抑制作用，對產生菌自身也有殺死或抑制作用，即抗生素對產生菌自身存在 著毒害作用。隨著卷曲霉素在發酵液中濃度不斷增高，其產生菌受到高濃度產物的反饋調 節作用，使產生菌生物細胞及酶的潛力不能充分發揮，造成卷曲霉素的產率難W提高，從而 成為制約提高卷曲霉素發酵水平的瓶頸。選育能耐受高濃度卷曲霉素的產生菌固然可W使 生產指標得W提高，但并不能從根本上解決問題。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是解決現有技術中微生物發酵制備卷曲霉素存在的發酵水平低的 問題，提供一種通過優化發酵培養基配方、發酵條件，在發酵過程中添加前體物質，促進卷 曲霉素的生物合成，從而提高卷曲霉素產量的方法。
[0008] 本發明所提供的一種發酵生產卷曲霉素的方法，包括W下步驟： a、制備卷曲鏈霉菌菌株的種子液 將卷曲鏈霉菌菌株的斜面培養物或抱子液接種于種子培養基，26-30°C、培養48-72 h 獲得種子液。
[0009] 其中所述的種子培養基按W下方法制得:薦糖20.0-40.0克、酵母粉5.0-10.0克、 硫酸錠2.0-3.0克、玉米漿2.0-8.0克、氯化鋼0.5-2.0克、碳酸巧3.0-6.0克，加水定容至 lOOOmUp 冊.5-7.0，121°(3滅菌3〇111111。
[0010] 本發明所述卷曲霉素產生菌可選用菌種編號NRRL2773的菌種。
[0011] b、制備卷曲鏈霉菌菌株的發酵液 將上述種子液W體積百分比7-10%的接種量接種于發酵培養基，在發酵罐中發酵，發酵 24-56小時之間加入前體物質賴氨酸;總發酵時間120-144時間，培養溫度27-29 °C，得到 發酵液。
[0012] 其中所述發酵培養基按W下方法制得:玉米淀粉20.0-30.0克、棉巧蛋白粉0-20.0 克、黃豆餅粉0-20.0克、酵母粉0-5.0克、硫酸錠2.0-4.0克、玉米漿4.0-8.0克、憐酸二氨鐘 2.0-4.0克、氯化鋼1.0-2.0克、碳酸巧4.0-6.0克，加水定容至10001^，9冊.5-7.0，121°(3滅 菌30min。
[0013] 本發明的進一步改進在于:所述步驟b中前體物質添加量為每升發酵液加入0.5- 2g〇
[0014] 本發明的進一步改進在于:所述步驟b中發酵罐壓為0.05 ± 0.0 IMpa、通氣比為1: 0.8-1.2vvm、攬拌速度為 300-400巧m。
[0015] 本發明的進一步改進在于:所述步驟b中發酵48-72小時之間加入經過滅菌后的超 順磁性微球。
[0016] 本發明的進一步改進在于:所述超順磁性微球粒徑為5-30um，粒徑分布為單分散， 表面的功能基團為簇酸基團，超順磁性微球為經過經氨氧化鋼溶液處理后的鋼型結構。
[0017] 本發明的進一步改進在于:超順磁性微球添加量為每升發酵液加入10-20g。
[0018] 所述超順磁性微球在使用前用2-5倍(v/w)的2moL/L的化OH水溶液，靜態浸泡2-4 小時后過濾，然后用去離子水洗涂至pH值至為7-8,置于密閉容器內，120°C，壓力為97kPa 下，滅菌30min。發酵完成后，超順磁性微球經外加磁場回收后用酸性水溶液洗脫吸附的卷 曲霉素。
[0019] 由于采用了上述技術方案，本發明取得的技術進步是： 采用卷曲鏈霉菌菌株為出發菌株，在微生物發酵生產兩性霉素 B的過程中，優化初始pH 值、發酵溫度及時間、接種量、培養基等條件，在卷曲霉素產物合成期，添加適量的前體物 質，在促進有效合成卷曲霉素的同時又避免了菌株中毒。還通過添加超順磁性微球，降低產 物對產生菌的反饋抑制，從而顯著提高了卷曲霉素產量。
[0020] 本發明的有益效果： 上述優選條件，所獲得卷曲霉素的產量從8166 ug/ml提高到14149ug/ml，為卷曲霉素 的工業化生產提供了一種方法。本發明中通過優化配方和發酵條件，保證了批次間發酵單 位的穩定性;加入前體物質后可顯著促進卷曲霉素的生物合成，與不添加前體物質相比，發 酵單位提高20%W上;添加超順磁性微球后可吸附發酵液中的卷曲霉素，降低發酵產物對產 生菌的反饋抑制，與不添加超順磁性微球相比，卷曲霉素產量提高24%;綜合優化后，發酵單 位提高73%，提高了產能，降低了能耗及廢棄物的排放。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。 下述實施例中所用的實驗材料劑如無特殊說明均為工業級原料;試劑購自北京化工廠，超 順磁性微球由蘇州納微生物科技有限公司提供。
[0022] 實施例1、化自動發酵罐發酵制備卷曲霉素 卷曲鏈霉菌菌株的種子液 將卷曲鏈霉菌菌株的斜面培養物或抱子液接種于種子培養基，26°C、220 rpm、培養72 h獲得種子液； 其中所述的種子培養基按W下方法制得:薦糖20.0克、酵母粉10.0克、硫酸錠2.0克、玉 米漿2.0克、氯化鋼0.5克、碳酸巧4.0克，加自來水定容至lOOOmUp冊.5，121°C滅菌30min。 本發明所述卷曲霉素產生菌為編號NRRL2773的菌株。
[0023] 發酵培養基組成： 玉米淀粉60.0克、黃豆餅粉60.0克、硫酸錠12.0克、玉米漿12.0克、憐酸二氨鐘12.0克、 氯化鋼6.0克、碳酸巧12.0克，加自來水定容至3000血，P冊.5，12 rC滅菌30min，化自動發酵 罐發酵培養。
[0024] 發酵條件:罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比為l:1.2vvm，裝料量為化，種子培養7化后 接種，接種量為10%，培養溫度29°c，轉速300 r/min，發酵培養開始24小時后加入賴氨酸，每 升發酵液加入〇.5g，總發酵時間120 h。
[0025] 結果見表1，在發酵過程中加入前體物質賴氨酸，發酵結束后，測定卷曲霉素的發 酵單位為9881ug/ml。
[0026] 實施例2、化自動發酵罐發酵制備卷曲霉素 卷曲鏈霉菌菌株的種子液 將卷曲鏈霉菌菌株的斜面培養物或抱子液接種于種子培養基，28°C、220 rpm、培養64 h獲得種子液； 其中所述的種子培養基按W下方法制得:薦糖40.0克、酵母粉5.0克、硫酸錠3.0克、玉 米漿8.0克、氯化鋼1.0克、碳酸巧3.0克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121°C滅菌30min。
[0027] 本發明所述卷曲霉素產生菌為菌種編號NRRL2773的菌種。
[0028] 發酵培養基組成： 玉米淀粉30.0克、棉巧蛋白粉20.0克、酵母粉5.0克、硫酸錠2.0克、玉米漿8.0克、憐酸 二氨鐘2.0克、氯化鋼1.0克、碳酸巧6.0克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121°C滅菌 30min，化自動發酵罐發酵培養。
[0029] 發酵條件:罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比為l:0.8vvm，裝料量為1L，種子培養6地后 接種，接種量為8%，培養溫度29°C，轉速為400 r/min，在發酵培養開始56小時加入賴氨酸， 每升發酵液加入1.5g，總發酵時間144 h。
[0030] 發酵結束后，經檢測卷曲霉素的發酵單位為1135加 g