高光學純l-高絲氨酸及其衍生物的生物合成方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種高光學純心高絲氨酸及其衍生物的生物合成方法，特別設及一種 W丙酬酸與醒類化合物為原料，在醒縮酶及甲酸脫氨酶和心氨基酸脫氨酶復合酶催化下制 備高光學活性k高絲氨酸及其衍生物的方法，屬于生物合成技術領域。
【背景技術】
[0002] 心高絲氨酸是一種非蛋白氨基酸，由于其結構活性，k高絲氨酸及其衍生物，在藥 物學、生物學、植物生理學、膚合成等方面越來越得到科研工作者的認識，其主要用途是作 為醫藥中間體。
[0003] 目前，國內外L高絲氨酸的生產方法分為化學法和生物法。化學法是比較經典的方 法，主要有化學合成和化學拆分。化學合成主要是Wレ蛋氨酸和甲基化試劑艦甲燒為起始 原料，經親核反應生成艦甲基-k蛋氨酸，再在碳酸氨鐘的作用下合成心高絲氨酸。化學拆 分法是用手性拆分試劑和混旋高絲氨酸形成非對應異構體進行拆分得到心高絲氨酸，光學 純度可達98%，但是此方法需要昂貴的手性拆分試劑，成本較高，工業生產不易采用，而且 產生大量的有機溶劑會污染環境。
[0004] 生物法又包括微生物發酵法和細胞外酶轉化法，微生物發酵法專屬性較強，條件 溫和，環境污染少，但存在反應產物成分復雜，分離繁瑣的缺點；酶催化轉化則是一種高選 擇性反應，不同種類的酶可作用于不同構型和不同種類的特定底物，從而達到定向轉化的 目的。目前酶法制備心高絲氨酸國內外尚無報導。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中心高絲氨酸的合成方法存在過程繁瑣、反應條件苛刻、收率低、分 離提純困難、環境污染嚴重等一系列缺陷，本發明的目的是在于提供一種W廉價的丙酬酸 和甲醒為原料，利用Ξ種酶組合兩步催化，高產率獲得レ高絲氨酸的方法，該方法綠色環 保、反應條件溫和、成本低，滿足工業要求。
[0006] 為了實現上述技術目的，本發明提供了一種高光學純心高絲氨酸及其衍生物的生 物合成方法，該方法為:在反應液中，丙酬酸與醒類化合物原料在醒縮酶的催化作用下，進 行反應I;反應I所得產物在甲酸脫氨酶和k氨基酸脫氨酶復合酶的催化作用下，進行反應 II，反應II所得產物依次經過層析分離、脫鹽、脫色、濃縮結晶、干燥處理，得到心高絲氨酸 或心高絲氨酸衍生物；
[0007] 所述的丙酬酸具有式1結構：
[000引
[0009]所述的醒類化合物具有式2結構：
[0010]
[0011] 所述的心高絲氨酸衍生物具有式3的結構：
[0012]
[001引其中，R為氨、烷基或芳基；
[0014] 化為烷基或芳基。
[0015] 本發明的技術方案首次丙酬酸與醒類化合物原料依次在醒縮酶及甲酸脫氨酶和 k氨基酸脫氨酶復合酶的催化下分兩步制備k高絲氨酸或k高絲氨酸衍生物;其合成路線 為甲醒的反應為例）：
[0016]
[0017]反應原理為甲醒的反應為例）：
[001 引
[0019] 該酶催化反應過程中，主要利用甲酸脫氨酶來推動L-氨基酸脫氨酶催化中間體 4-徑基-2下酬酸轉化生成心高絲氨酸，同時也實現輔酶因子NA護/NADH的循環再生，可W大 大減少昂貴NA護的用量，降低了成本。該方法通過選擇特殊種類的酶，原料轉換率高、選擇 性單一，結合層析分離、脫鹽等方法，能夠得到純度和產率高的心高絲氨酸及其衍生物。
[0020] 本發明的高光學純心高絲氨酸及其衍生物的生物合成方法還包括W下優選方案：
[0021] 優選的方案，醒縮酶相對于丙酬酸在反應液中的加入量為lOOOOU/mol~15000U/ mo 1，較優選為 11 OOOU/mo 1 ~13000U/mo 1，最優選為 12000U/mo 1。
[0022] 優選的方案，甲酸脫氨酶相對于丙酬酸在反應液中的加入量為lOOOOU/mol~ 15000U/mo 1，較優選為 11 OOOU/mo 1 ~13000U/mo 1，最優選為 12000U/mo 1。
[0023] 優選的方案，心氨基酸脫氨酶相對于丙酬酸在反應液中的加入量為4000U/mol~ 8000U/mo 1，較優選為 5000U/mo 1 ~7000U/mo 1，最優選為6000U/mo 1。
[0024] 優選的技術方案通過采用特定比例的醒縮酶、甲酸脫氨酶和心氨基酸脫氨酶復合 酶組合使用，能使原料轉化率高、得到充分利用。本發明的酶催化劑可W是混合液態酶或固 定化酶，也可W是工程菌。酶可W回收使用，利用率高，生產成本低。
[0025] 優選的方案，甲酸脫氨酶和心氨基酸脫氨酶復合酶中甲酸脫氨酶與心氨基酸脫氨 酶在反應液中的活力比為1.2~3:1，較優選為1.5~2.5:1，最優選為2:1。
[0026] 優選的方案，k氨基酸脫氨酶為心亮氨酸脫氨酶苯丙氨酸脫氨酶、心鄉氨酸脫 氨酶、1^-谷氨酸脫氨酶中的至少一種。
[0027] 優選的方案，醒縮酶為唾液酸醒縮酶或脫氨泛解酸醒縮酶。
[00%]優選的方案，丙酬酸在反應液中的質量百分比濃度為5%~10%。
[0029] 優選的方案，反應液中醒類化合物與丙酬酸的摩爾比為1:0.3~0.8。
[0030] 優選的方案，反應II中添加 NAD+輔酶因子。
[0031] 優選的方案，NAD+輔酶因子相對于丙酬酸在反應液中的加入量<0.06g/mol。
[0032] 優選的方案，反應I的條件為:pH為6.0~8.0，溫度為20~40°C。反應I的反應時間 為3~化。
[0033] 優選的方案，反應II于抑為6.0~8.0,溫度為20~40°C。反應II的反應終點為中間 體(4-徑基-2下酬酸衍生物)轉換率達到達到99% W上。
[0034] 優選的方案，層析分離通過強酸性橫酸型樹脂或疏水性吸附樹脂實現。
[0035] 優選的方案，脫色通過木質活性炭實現，維持反應產物溫度在20~40°C范圍內，加 入木質活性炭進行吸附0.5~1.化;木質活性炭的使用量為反應產物(主要為含心高絲氨酸 的溶液)體積的3.0~5.0%〇。
[0036] 優選的方案，反應II的產物通過脫鹽純化工序，有效地去除了物料的雜質和色素， 極大提高了結晶粉的質量。
[0037] 優選的方案，干燥過程為真空干燥，在真空度大于0.09MPa，溫度在60~80°C范圍 內的條件下進行。
[0038] 相對現有技術，本發明的技術方案帶來的有益技術效果：
[0039] 1、本發明首次將醒縮酶及甲酸脫氨酶和心氨基酸脫氨酶相結合，通過兩步酶法催 化丙酬酸和醒類化合物原料進行酶催化反應，再結合適當的提純分離方法，高產率獲得高 光學純度心高絲氨酸，收率相對于化學法要高20~50% W上，相對于菌體法提純容易，產品 純度達到99 % W上。
[0040] 2、本發明的原料來源廣，酶可W重復使用，不需要使用大量有機溶劑和有毒原料， 相對現有技術中的化學方法大幅降低生產成本，提高了手性純度，相對于發酵菌體法廢水 量少，有利于保護環境。
[0041 ] 3、本發明的方法步驟簡單，反應條件溫和，對設備要求低，只需在常溫下反應，不 需要現有技術中的高溫設備反應。
[0042] 4、本發明的方法適用于多種醒類和丙酬酸之間的反應，可W獲得多種L-高絲氨 酸衍生物。
【附圖說明】
[0043] 【圖1】為實施例1制得的產品的液相色譜分析圖。
[0044] 【圖2】為實施例4制得的產品的液相色譜分析圖。
[0045] 【圖3】為實施例5制得的產品的液相色譜分析圖。
【具體實施方式】
[0046] 實例中的原料來源及分析儀器:醒縮酶、甲酸脫氨酶和心氨基酸脫氨酶(湖南福來 格生物技術有限公司）；丙酬酸(江蘇倍達醫藥科技有限公司）；甲醒溶液(長沙安泰精細化 工實業有限公司）；乙醒(廣東燦頭市西晚化工廠）；苯甲醒（西晚化工股份有限公司）；強酸 性橫酸型樹脂或疏水性吸附樹脂（長沙承禹化工有限公司）；高效液相色譜LC-10AT/SPD-10A(日本島津)。
[0047] W下實施例1~5中酶的加入量是相對于丙酬酸的加入量。
[004引實施例1
[0049] 取88. Og丙酬酸加入適量去離子水溶解后，加入125mL甲醒溶液(37 %~40 % )，并 用6. Omol/L氨水溶液調節pH為7.5 ±0.1，去離子水定容至lOOOmL。投固定化醒縮酶12000U， 控制反應溫度30°C±1°C，當液相檢測丙酬酸摩爾轉化率^99%時，過濾分離，收集此反應 終止液，加入50mL甲酸，并用6.Omol/L氨水溶液調節pH為7.5±0.1，再加入NAD 0.06g，投液 態甲酸脫氨酶12000U、液態k氨基酸脫氨酶6000U，控制反應溫度30°C±rC，用3mol/L的鹽 酸溶液保持pH為7.5 ± 0.1，當液相檢測4-徑基酬酸轉化率^ 99 %時，進行酶液分離。收集此 反應終止液，進行脫鹽純化，得到含108.64g k高絲氨酸溶液1310mL，產率為91.20%。經離 子交換層析分離純化，得到含有103.78g k高絲氨酸溶液967mL，產率87.12%。物料中投加 5%。的活性炭脫色半小時，過濾后取濾液在60°C，-0.09MPa~-0.098MPa負壓下蒸發濃縮，過 濾、干燥，得到含量為99.78%的心高絲氨酸干粉98.92g，總產率83.04%。
[(K)加]實施例2:
[0051 ] 取88. Og丙酬酸加入適量去離子水溶解后，加入188mL甲醒溶液(37 %~40 % )，并 用6. Omol/L氨水溶液調節pH為7.5 ±0.1，去離子水定容至lOOOmL