一種維吉尼亞鏈霉菌ibl14產青霉素重組菌株的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫藥領域，確切地說是一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組 菌株的構建方法。
【背景技術】
[0002] 青霉素是英國人Alexander Fleming 1928年意外發現地一種毒性低、療效高的抗 生素(許鐘巧.（2005)發現青霉素.健康博覽，29)。1939年，Fleming將歷時10年培養的菌種 提供給牛津大學澳大利亞病理學家弗洛里（Howard Florey)和英國生物化學家錢恩 化arnest化ain)J940年，他們完成了制備青霉素結晶體和動物實驗(林蔭.（2007)青霉素 的輝煌往事.科學24小時，40-42)。1941年，第二次世界大戰爆發，美國政府下達了大規模 量產青霉素，W供戰時之需的艱巨任務，當時的輝瑞公司采用其特有的深罐發酵技術完成 了任務，成為了世界上首個量產青霉素的公司（許鐘巧.（2005)發現青霉素.健康博覽，29)。 從發現到量產歷時14年，臨床首選于G+球菌所致的感染。
[0003] β-內酷胺抗生素是具有四元內酷胺環的一大類抗生素，主要代表有青霉素和頭抱 菌素。青霉素具有與細菌細胞壁膚聚糖單體中D-丙氨酷-D-丙氨酸相似的結構，與其競爭轉 膚酶，阻礙膚聚糖的形成，造成細胞壁的缺損，進而起到殺菌作用(于海軍.（2009)β-內酷胺 類抗生素作用機制及頭抱菌素發展.石家莊職業技術學院學報.21,12-16)。
[0004] β-內酷胺酶是一類破壞β-內酷胺環抗生素酶的總稱。它使β-內酷胺環水解開環生 成青霉素嚷挫酸，該酶功能的缺失可使得維吉尼亞鏈霉菌IBL14中青霉素得到積累，同時β-內酷胺酶和青霉素酷胺酶水解基因和頭抱菌素代謝支路中的異青霉素-Ν異構酶基因的缺 失使得維吉尼亞鏈霉菌IBL14中青霉素的產量得到進一步的提高。
[0005] 眾所周知，當前青霉素生產的主要菌株是真菌（如：產黃青霉Penicillium chrysogenum和點青霉化nicillium nota化m)，由細菌維吉尼亞鏈霉菌生產青霉素未見報 道。
[0006] 近年來，基于CRISPR-Cas系統發展而來的DNA編輯新技術，成功地應用于細胞染色 體中基因組編輯與改造，在醫藥、食品、農業等領域中顯示出了巨大的潛力（Doudna， J.A.and Charpentier,E.(2014)The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346)。但到目前為止，廣泛應用的CRISPR-Cas系統均為CRISPR-Cas II型系統。
[0007] 維吉尼亞鏈霉菌IBkl4(Streptomyces virginiae IBL14)是本實驗室自行分離 純化得到的一株能降解多種醬體化合物的放線菌。對菌株IBkl4全基因組測序和數據庫分 析發現，菌株IBkl4中存在CRISPR-Cas I-SV14B型系統。應用維吉尼亞鏈霉菌IBkl4自身 的化S I-SV14B型系統對其生產青霉素的相關基因進行編輯，得到生產青霉素重組菌株未 見報道。此外，該方法的建立對其他抗生素的生產也具有指導意義。
【發明內容】
[0008] 本發明要解決的技術問題是提供一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的 構建方法，通過祀向基因與基因編輯模板的設計與質粒構建及祀向基因與基因編輯模板重 組質粒在鏈霉菌中的轉化操作，對染色體中與產青霉素相關的基因進行編輯。本發明通過 敲除青霉素水解酶、青霉素酷胺酶及異青霉素-N異構酶的基因，從而實現提高青霉素產量 之目的。
[0009] 采用如下技術方案：
[0010] -種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的構建方法，其特征在于:包括W下 步驟；
[0011] (1)根據維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因組測序數據，確定β-內酷胺酶、青霉素酷胺酶 及異青霉素-Ν異構酶Ξ個祀向基因的DNA序列；
[001引（2)使用Pfu DNA聚合酶通過PCR反應分別擴增得到末端帶削良制性內切酶識別切 割位點的，且具有overlap PCR互補序列的祀向基因上、下同源臂的PCR片段；
[0013] (3)利用overlap PCR反應將上、下兩個同源臂結合構建編輯基因模板；
[0014] (4)直接合成首、尾分別包含啟動子J23119和RNA終止子的祀向基因片段；
[001引（5)利刷良制性酶切位點上的粘性末端和連接酶將步驟(3)、步驟(4)獲得的DNA片 段連接到地C1139上得到基因編輯質粒；
[0016] (6)在含鏈霉菌的高滲溶液中添加溶菌酶制備維吉尼亞鏈霉菌IBL14原生質體；
[0017] (7)將步驟巧）中得到基因編輯質粒轉化到維吉尼亞鏈霉菌IBL14原生質體中得到 基因編輯后的重組子；
[0018] (8)對重組子染色體進行PCR和基因測序分析，確證重組子為基因編輯后的目的重 組菌株，并根據抑菌圈實驗結果篩選抗性能力強的目的重組菌株。
[0019] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的構建方法，其特征在于:維 吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中β-內酷胺酶基因及產青霉素基因具有如表1所描述的核巧酸 序列，其青霉素合成途徑中的異青霉素-Ν異構酶的功能缺失導致異青霉素-Ν不能轉化為青 霉素 Ν，β-內酷胺酶和青霉素酷胺酶的功能缺失導致青霉素不能分別轉化為青霉酸和6氨基 青霉燒酸，進而共同導致青霉素的積累。
[0020] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的構建方法，其特征在于:所 述的構建青霉素重組菌株是應用維吉尼亞鏈霉菌IBL14中自身的CRISPR-化S I-SV14B型系 統對維吉尼亞鏈霉菌IBL14中主要影響青霉素生產的β-內酷胺酶基因、青霉素酷胺酶基因 及異青霉素 -Ν異構酶基因進行敲除、插入、無痕點突變及任意組合。
[0021] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的構建方法，其特征在于:該 方法構建所得到的維吉尼亞鏈霉菌IBL14重組菌株可直接用于青霉素及其衍生物生產。
[0022] 一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產青霉素重組菌株的構建方法，其特征在于:維吉尼亞 鏈霉菌IBL14染色體中含有水解青霉素的β-內酷胺酶(β-lactamase)基因和產青霉素基因 簇、及因此而建立的一種產青霉素重組菌株的構建方法。本發明目的通過W下技術方案來 實現：
[0023] 所述的維吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中水解青霉素的基因和產青霉素基因簇具有 如表1所描述的核巧酸序列、且酶生產青霉素過程具有如附圖1所示的代謝途徑。
[0024] 有益效果：
[00巧]本發明首創了維吉尼亞鏈霉菌生產青霉素的途徑;提供了CRISPR-CAS I-SV14B型 系統在鏈霉菌抗生素生產中的應用；為CRISPR-CAS I-SV14B型系統在其它抗生素生產菌株 研究中提供了新的方法和技術選擇。應用維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas I-SV14B 型基因編輯系統對鏈霉菌遺傳基因進行編輯可方便、快速、高效地改變生物體的遺傳特征。 該基因編輯的方法可應用于生物制藥、食品、農業及其它生物應用領域中。
[0026] 說明書附圖
[0027] 圖1維吉尼亞鏈霉菌IBL14青霉素代謝途徑;異青霉素 -N異構酶/EC 5.1.1.17的功 能缺失導致異青霉素 -N不能轉化為青霉素 N(penicillin N)，β-內酷胺酶/EC3.5.2.6的功 能缺失導致青霉素不能轉化為青霉酸(penicilloic acid)，青霉素酷胺酶/EC3.5.1.11的 功能缺失導致青霉素不能轉化為6氨基青霉燒酸
[002引 （6-aminopenicillanic acid)，進而共同導致青霉素(penicillin)的積累；注:紅 色虛線代表被敲除基因；
[0029] 圖2抑菌圈抗性檢測，其中A表明野生型I化14對大腸桿菌D冊α無抑制;B表明敲除 后的重組子對大腸桿菌Μ15α有抑制。
【具體實施方式】
[0030] 為了更充分理解本發明的技術內容，下面結合具體實施例對本發明的技術方案作 進一步介紹和說明，旨在更好的解釋本發明的內容，W下實施例不限制本發明的保護范圍。 此外，在所列實施例中如無特別說明均采用如下材料：
[003。 1)菌種
[0032] 宿主為Str邱tom