重組人肝細胞溶質抗原Ⅰ真核表達載體構建和表達方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程和生物工程技術領域，特別是設及一種重組人肝細胞溶質抗 原I真核表達載體構建和表達方法。
【背景技術】
[0002] 自身免疫性肝病(ALD)是一類原因不明的、免疫介導的W肝臟為祀器官的自身免 疫性疾病，主要包括W肝細胞胞實質損害為主的自身免疫性肝炎(autoimmune h巧atitis, AH)、和W膽管病變為主的原發性膽汁性肝硬化(prima巧billia巧cirrhosis,PBC)、原發 性硬化性膽管炎(primaiy sclerosing cholangitis,PSC)S組疾病。近年來由于對此類疾 病研究的不斷深入W及臨床上相關免疫學檢測試劑盒不斷涌現，發現我國人群中ALD患者 不斷增多。
[0003] 抗肝細胞溶質抗原I型抗體(anUbody to liver巧tosol 1 ,LC-1)是Π 型ALD的 一項重要血清學標志，主要存在于兒童和青少年患者中，一般年齡在20歲W下。亞胺甲基轉 移酶、環化脫氨酶和精氨基班巧酸裂解酶被確認是LC-1的祀抗原。LC-1抗體對自身免疫性 肝炎的特異性較高，但出現率較低，在大約10%的患者中抗LC-1抗體僅僅是Π 型ALD的血清 學標志。LC-1抗體出現在大約30%的Π 型ALD患者中，而且會和LKM-1(抗肝/腎微粒體抗原1 抗體)一起出現，約50-60%抗LKM-1抗體陽性患者同時抗LC-1抗體陽性。LC-1抗體滴度與疾 病活動程度、血清轉氨酶和丙種球蛋白水平明顯相關。高效價的抗-1X1只在有著高活動度 的慢性肝炎或肝硬化中檢測到。目前，LC-1抗原主要是利用陽性血清通過對流免疫電泳分 離得到的，但由于LKM-1和LC-1抗體往往同時存在，LC-1抗體獨特的間接免疫巧光圖案有可 能會被掩蓋住。
【發明內容】
[0004] 本發明主要解決的技術問題是提供一種重組人肝細胞溶質抗原I真核表達載體構 建和表達方法，得到人肝細胞溶質抗原I融合蛋白及其編碼基因，實現利用真核表達系統高 效表達、生產重組人肝細胞溶質抗原I。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種重組人肝細胞溶 質抗原I真核表達載體構建和表達方法，包括步驟為： (1) 合成人肝細胞溶質抗原I基因； (2) 將所述人肝細胞溶質抗原I基因經過限制性內切酶消化后與經過限制性內切酶消 化的真核表達載體在T4連接酶的作用下進行連接，再轉化大腸桿菌D冊α感受態細胞，經過 鑒定得到帶有人肝細胞溶質抗原I基因片段的重組載體； (3) 將鑒定后的所述重組載體轉染進入真核細胞中表達得到重組蛋白； (4) 對所述重組蛋白進行親和純化，得到目的蛋白。
[0006] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體是具有多克隆位點且 能通過多個調控原件在真核表達系統調控進而表達插入基因的分子生物學載體。
[0007]在本發明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體是能通過信號膚進行 分泌表達或者不帶有信號膚進行胞內表達的載體。
[000引在本發明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述真核表達載體為PCDNA3.1(+)載體。
[0009] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述真核細胞是能表達外源基因的真核 細胞，所述真核細胞不局限于宿主細胞。
[0010] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述真核細胞為HEK293細胞系。
[0011] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述轉染為促進外源基因進入宿主細胞 的方法，所述轉染包括化學轉染和物理轉染。
[0012] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述轉染為脂質體轉染方法。
[0013] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述純化為利用蛋白的物理性質通過色 譜柱進行親和純化，得到目的蛋白。
[0014] 在本發明一個較佳實施例中，步驟(3)中所述純化為采用儀柱對目的蛋白進行純 化。
[0015] 本發明的有益效果是:本發明的重組人肝細胞溶質抗原I真核表達載體構建和表 達方法，能實現重組的LC-1抗原成功表達，使用重組的LC-1在免疫學檢測中能解決間接免 疫巧光圖案被遮蓋的問題。
【附圖說明】
[0016] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據運些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發明中口。0臟3.1(+)/扣111曰111(：-1重組質粒化6巧郵曰11^1雙酶切鑒定圖，其中1 為DNAMarker，泳道l為pcDNA3.1(+)AumanLC-l重組質粒Mle巧郵amHI雙酶切； 圖2是本發明中人LC-1基因融合的陰性血清和陽性血清Western blot分析圖，泳道1為 陰性血清，泳道2為陽性血清，Μ為Marker。
【具體實施方式】
[0017] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[001引實驗材料； 菌株、細胞和載體：大腸桿菌DH5a、HEK293細胞系和PCDM3. 1( + )載體均購自 Invitrogen 公司。
[0019]酶與試劑:限制性內切酶和T4連接酶為Thermo公司產品。
[0020]生化試劑：0PTI-MEMI reduced serum medium，Lipofectamine 2000，TRIzol試劑 購自Invihogen公司；DMEM高糖型培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公 司；His tag抗體購自Cell Si即aling化chnology公司；E化化學發光試劑盒購自化ermo公 司；大腸桿菌培養基為LB，其含有質量體積比(w/v)為1%的蛋白腺、質量體積比(w/v)為ο. 5% 的酵母提取物、質量體積比(w/v)為1%的化C1，抑值為7.0,膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒 和去內毒素質粒提取試劑盒購自Omegabiotek公司。
[0021] 實施例一； 人LC-1基因人工合成 根據GenBank已公開的人Formimidoyltransferase-cyclodeaminase 邑ene的mRNA序列 (GenBank序列登錄號:AF289024)，在該基因的5'端添加 Nhel酶切位點，在該基因的3'端的 終止密碼子之前添加適用于后續融合蛋白純化的6X化S標簽的基因序列，在3'端的終止密 碼子之后添加 BamH I酶切位點，見SEQ ID N0.1，氨基酸序列見SEQ ID N0.2。
[0022] 實施例二 帶有人LC-1基因的重組PCDNA3.1(+)的構建 (l)Human LC-1 基因雙酶切：LC-1(質粒）2yg、MieI 2yl、BamH I 化l、10XfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混勻，12000rpm離屯、5秒，37°C酶切30min。
[0023] (2)載體雙酶切：PCDNA3.U+)載體化g、NheI 2yl、BamH I 化UlOXfastDigest buffer 化1，增加 dd出0至50.0μ1，混勻，12000rpm離屯、5秒，37°C酶切30min。
[0024] (3)使用試劑盒回收雙酶切產物:酶切產物加10μ1 eXLoading buffer、質量體積 tt (w/v)為1.0%的瓊脂糖凝膠(含邸）電泳30min，經回收，得到human LC-1基因和PCDNA3.1 (+)載體的酶切產物。
[0025] (4)連接反應（1化1體系）:LC-1基因酶切產物7.扣1、pcDNA3.1 (+)載體的酶切產物 1μ1、10 X T4連接酶buf f