Bsmv-vigs重組載體及其在小麥產量性狀基因研究中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于農業應用生物技術領域，尤其設及一種BSMV-VIGS重組載體及其在小 麥產量性狀基因研究中的應用。
【背景技術】
[0002] 病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系統是近年來發 展起來研究基因功能的新方法，它的原理主要是：當攜帶目標基因 cDNA的病毒載體浸染植 物細胞后，在植物細胞內復制與表達過程中會形成雙鏈RNA形式的中間體(dsRNA)，dsRNA作 為基因沉默的激發子，首先在細胞中被特異核酸內切酶切割成小片段的RNA(siRNA)，然后 siRNA在植物細胞內被RNA聚合酶進一步擴增，并W單鏈形式與一些特異蛋白（AG01)等結合 形成RNA誘導的沉默復合體，此沉默復合體又特異與胞質中同源RNA互作，造成同源RNA降解 導致產生轉錄后水平的基因沉默。
[0003] 小麥是世界上Ξ大重要糧食作物之一，其中普通小麥(Triticum aestivum L.)產 量占全世界小麥總產90% W上。普通小麥是異源六倍體，含有A、B和DS套染色體組，95% W上 的基因存在3個或更多拷貝，其基因組非常龐大（17000Mb，分別是水稻和玉米基因組的40倍 和7倍），而且結構復雜(85%W上序列為重復序列）；同時，由于小麥基因型的依賴性很強、品 種間再生能力差異顯著，導致穩定的再生體系尚未建立，成為現今世界上最難轉化的作物 之一。運些主要因素導致了現今小麥分子機理的研究遠落后于基因組較小、轉化相對容易 的水稻等其它主要農作物。雖然已有一些小麥抗逆基因在擬南芥、煙草和水稻等轉化較為 容易的植物上進行了功能驗證，但對于控制小麥巧粒淀粉、蛋白質等產量性狀基因來說，由 于物種間產量性狀及生長環境的差異性(水稻等屬于喜溫的秋糧作物，生長在溫度較高的 夏季;而小麥屬于喜涼的越冬作物，大部分時間生長在溫度較低的冬季與春季），小麥產量 性狀基因的功能不適宜在水稻等基因組簡單、轉化容易的作物上進行。因此，摸索出一種適 合研究小麥產量性狀基因功能的研究方法，有助于深入掲示小麥產量性狀形成的分子機 理。
[0004] VIGS方法克服了遺傳轉化困難植物基因功能研究方法的局限性，主要有W下優 點：（1)VIGS能直接在個體中鑒定基因功能缺失的表型，無需通過耗費較長的時間篩選大量 再生植株個體來鑒定轉基因植株，可快速鑒定基因功能；（2)它是一種瞬時基因沉默方法， 不需要復雜的遺傳轉化體系；（3)能通過對基因家族中高度保守的序列進行沉默來克服基 因功能冗余現象；（4)可快速比較同一基因在不同物種中的功能，W進行比較基因組學研 究。上述優點對于遺傳轉化困難、且基因組龐大而復雜的普通小麥來說，非常適用，因此， VIGS已在小麥基因功能研究上開始應用。
[0005] 但現今國內外運用VIGS方法研究小麥基因的功能均在實驗室培養箱內或溫室內 等易控條件下（人工可設定的溫度、濕度、光照等可控的生長條件)進行小麥抗逆基因的功 能研究。但培養箱或溫室可控條件下與田間多變條件下的小麥植株的生長狀況有一定差 異。如培養箱或溫室中小麥植株生長發育表現出分葉率較差、生育期縮短、生育后期植株早 衰、千粒重較低、產量顯著低于田間生長的小麥植株等現象，導致在培養箱或溫室環境下利 用VIGS方法研究小麥基因功能、特別是產量性狀基因的功能有一定局限性。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種BSMV-VIGS重組載體，利用該載體可在田間自然條件 下，建立一種研究小麥產量性狀基因功能的有效方法，有利于深入掲示小麥產量性狀基因 功能的分子機制，W指導小麥的育種工作。
[0007] 本發明的研究思路為：利用大麥條紋花葉病毒（barley shipe mosaic virus, BSMV)重組構建含有α、β和丫 S條不同的單鏈RNA的BSMV載體系統(如圖1所示）。分別將 上述Ξ條鏈的RNA反轉錄合成cDNA后，克隆到對應的pBSMV載體上。該載體包含有T7啟動子 和轉錄原點，可通過T7 RNA聚合酶W線性化BSMV載體為模板體外進行轉錄，獲得病毒 RNA，用轉錄得到的3條鏈的RNA轉錄本等量摩擦接種植物后，病毒RNA在植物體內能形成 具有活性的基因組，進行增殖傳播。在丫 b之后有一個Nhel酶切位點，可將目標基因片段通 過分子克隆構建到BSMV-丫載體上，目標基因片段可W隨著病毒自身基因組的復制而得到 復制，并通過轉錄后水平沉默目標基因。
[0008] 為完成上述目的，本發明采用W下技術方案來實現的： 構建了一種BSMV-丫：TaRSRl重組載體，其為含有目標基因片段、隧菌體η ori、抑制 因子laci、大腸桿菌El因子o;ri、0-內酷胺酶基因 bla、T7啟動子的病毒RNA，所述目標基因片 段為沈Q ID N0.1所示的化RSR1轉錄因子mRNA部分cDNA序列。
[0009] 上述重組載體的制備方法，包括W下步驟： (1)化RSR1轉錄因子mRNA部分cDNA片段的克隆 提取小麥巧粒的總RNA，并通過反轉錄獲得與小麥總RNA對應的cDNA，取所得cDNA作為 模板，通過PCR擴增化RSR1轉錄因子片段序列，用所得擴增產物進行電泳檢測、切膠回收，將 回收所得擴增產物連接至PMD18-T simple載體，再轉化大腸桿菌D冊α，然后，挑取驗證過的 陽性單克隆，進行測序鑒定； (2化SMV- 丫： TaRSRl重組載體的構建、轉化與篩選 取測序正確的化RSR1-PMD18-T simple質粒與BSMV-丫： GFP質粒分別用限制性內切酶 Nhe I單酶切，再進行電泳檢測、切膠回收，分別得到純化的TaRSRl基因片段和BSMV-丫質 粒； 用T4-DNA連接酶將純化后的化RSR1基因片段連接至純化后的BSMV-丫質粒，得到BSMV-丫：化RSR1重組載體，再將其轉化至感受態大腸桿菌JM109,涂布在LB平板培養基上，LB平 板培養基經37°C過夜培養長出單菌落，將所得單菌落依次進行PC閲金證、重組質粒酶切驗證 和測序鑒定，挑選陽性菌落，得BSMV-丫：化RSR1重組載體。
[0010] 由等體積的 BSMV-cuBSMV-β、及上述 BSMV-丫： TaRSRl,加入 DEPC water 和 2XGKP buffer等混合均勻后，制成各載體濃度為500 pg/ml的病毒接種混合液，可用小麥產量性狀 基因功能的研究，用于指導小麥育種工作，也可直接將其用于小麥增產。
[0011] 上述病毒接種混合液的制備方法，包括W下步驟： (DBSMV載體線性化 用限制性內切酶Mlu I分別單酶切BSMV-a質粒和權利要求2所得BSMV-丫：化RSR1重組 質粒，使其線性化;用限制性內切酶Spe I單酶切BSMV-β質粒，使其線性化； (2) 體外轉錄生產病毒 取所得線性化BSMV-cuBSMV-β和BSMV- 丫： TaRSRl載體DNA分別進行體外轉錄、檢測和 保存； (3) 病毒接種混合液的制備 取等體積的 BSMV-a、BSMV-e、BSMV-丫： TaRSRl，與9倍于BSMV-a體積的DEPC water和 12倍于BSMV-a體積的2XGKP buffer混合均勻，即成。
[0012] 田間自然條件下研究小麥產量性狀基因功能的方法，包括W下步驟： 于小麥抽穗期，在田間創造一個高濕(濕度85%W上）、黃昏弱光、18~22°C低溫的環境， 用上述BSMV-VIGS沉默載體病毒接種混合液摩擦小麥穗部進行接種;接種后，于小麥開花期 和灌漿期保持高濕環境（小麥植株用薄膜拱棚覆蓋，處于相對封閉的空間，濕度達85%W 上）；同時，接種7天后對接種植株進行表型觀察、目標基因的轉錄水平檢測，成熟時進行產 量性狀測定。
[0013] 本發明具有W下積極有益技術效果： 1.本發明重組載體實現了田間條件下小麥產量性狀基因的沉默