LRR-RLK受體激酶AtMDIS1及其在打破物種間生殖隔離中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本申請設及但不限于生物技術領域，具體地設及擬南芥的LRR-RLK化eucine-rich repaeat-receptor like kinase)受體激酶AtMDISl(fele Discoverl)及其應用;更具體地 設及在花粉中特異表達的LAT52啟動子驅動擬南芥受體激酶編碼基因 AtMDISlW轉基因手 段打破物種間生殖隔離的技術。
【背景技術】
[0002] 由于各方面的原因，親緣關系接近的類群之間在自然條件下不交配，或即使能交 配也不能產生后代或不能產生可育性后代的隔離機制，被稱為生殖隔離。若生殖隔離發生 在受精W前，稱為受精前的生殖隔離，其中包括地理隔離、生態隔離、季節隔離、生理隔離、 形態隔離和行為隔離等;若生殖隔離發生在受精W后，就稱為受精后的生殖隔離，其中包括 雜種不活、雜種不育和雜種衰敗等。
[0003] 各種生殖隔離的實質都是阻礙不同物種間的基因交流，該隔離現象給農業生產造 成了困難，比如雜交時的雜種不育，使人們不能利用雜種優勢育種。運種生殖隔離給農業生 產造成了一定的負效應。如能實現打破植物的近緣雜交不親和，對不同物種之間的基因交 流W及農作物的增產具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本申請提供了一種DNA片段，所述DNA片段具有SEQ ID No.:l所示的核巧酸序列， 或與SEQ ID No.: 1具有60% W上的同源性、優選地75%或更高、更優選地85%或更高、進一 步更優選地90%或更高、最優選地95%或更高的同源性的核巧酸序列。運里使用的術語"同 源性"指與天然核巧酸序列的序列相似性。同源性可W用肉眼或計算機軟件進行評價。使用 計算機軟件，兩個或多個序列之間的同源性可W用百分比（％ )表示，其可W用來評價相關 序列之間的同源性。
[0005] 本申請提供了一種DNA片段，所述DNA片段的核巧酸序列與W上所述的DNA片段的 核巧酸序列互補。運里使用的術語"互補的"系指遵循堿基配對原則產生。
[0006] 本申請提供了含有W上所述的DNA片段的重組載體。在一些實施方案中，所述重組 載體可包括花粉特異表達啟動子;優選地，所述花粉特異表達啟動子可W是LAT52啟動子。 在一些實施方案中，所述重組載體可包括SEQ ID NO. :3所示的序列。
[0007] 本申請提供了包含W上所述的DNA片段的植株、細胞系或重組菌株。
[000引本申請提供了一種打破植物間生殖隔離的方法，所述方法包括:將W上所述的DNA 片段導入與其來源不同的另一種植物;獲得轉入所述DNA片段的植物。在一些實施方案中， 所述植物可為擬南芥W外的所有植物物種，優選地所述植物可為雙子葉植物或單子葉植 物，更優選地所述植物可為擬南芥的近緣物種和遠緣物種，最優選地所述植物可為擬南芥 的近緣物種。在一些實施方案中，所述擬南芥的近緣物種可W是十字花科(Cruciferae)云 苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜（B.chinensis L.)、圓白菜 (B.oleracea)、油菜（B.napus)、憲菁（Brassica rapa)、蘿h(Raphanus sativus)、 Arabidopsis lyrataXapsella 1'油611日;和/或所述擬南芥的遠緣物種可^是煙草、番茄、 小麥、玉米或水稻。
[0009]本申請提供了 W上所述的DM片段在提高植物雜交的親和性、打破生殖隔離中的 用途。在一些實施方案中，所述植物可為擬南芥W外的所有植物物種，優選地所述植物可為 雙子葉植物或單子葉植物，更優選地所述植物可為擬南芥的近緣物種和遠緣物種，最優選 地所述植物可為擬南芥的近緣物種。在一些實施方案中，所述擬南芥的近緣物種可W是十 字花科（Cruciferae)云苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜（B. chinensis L.)、圓白菜（B.oleracea)、憲菁（Brassica rapa)、蘿KRaphanus sativus)、Arabidopsis lyrata、Capsella 1'山3日11日;和/或所述擬南芥的遠緣物種可^是煙草、番茄、小麥、玉米或 水稻。
[0010] 本申請克隆了擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的膜定位受體AtMDISl并用基因 工程的方法轉入其近緣物種化psella rubella中，能夠增加 C.rubella花粉管識別成熟擬 南芥胚珠的效率。
[0011] 本申請所要解決的技術問題是用轉基因手段打破近緣雜交不親和的新方法。
[0012] 本申請提供的DNA片段的核巧酸序列如下：
[OOU] 擬南芥AtMDISl的核巧酸序列如沈Q ID NO. :1所示。
[0014] Capsella rubella中的MDIS1的直系同源基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. :2所 /J、- 〇
[0015] 本申請提供了一種在近緣物種中基因表達的方法，包括如下步驟:將本申請的擬 南芥DNA片段導入其近緣物種C.rubella中，得到轉基因植物，使得上述DNA片段在所述轉基 因植物中轉錄;與野生型植物相比，轉基因的C.rubella植物中表達了擬南芥的AtMDISl基 因。
[0016] 所述方法中從地1101 (Clontech)改造的最終表達載體，依次由lJVr52啟動子、酶切 位點、AtMDUl片段W及轉錄終止子NOS-Terminitor依次連接而成，序列如SEQ ID No. :3所 /J、- 〇
[0017] 總的來說，本申請利用在番茄花粉中特異表達的啟動子LAT52驅動AtMDISl,可W 高效地在十字花科（Cruciferae)云苔屬（Brassica)，包括白菜（B.pekinensis)、小油菜 (B. chinensis L .)、圓白菜（B. oleracea)、油菜（B .napus)、憲菁（Brassica rapa)、蘿h (Ra地anus sativus)、Arabidopsis lyrata、Capsella rubella和遠緣物種煙草、番茄、小 麥、玉米或水稻等等擬南芥W外其他植物的花粉管中表達。實驗證明，利用LAT52驅動 AtMDISl在花粉管中進行過表達，可W提高化psella rubella花粉管定向地導向未受精擬 南芥胚珠的效率。說明在擬南芥近緣物種化psella rubella中表達AtMDISl能夠提高轉基 因的C.rubella花粉管識別擬南芥胚珠的效率，從而增加異緣雜交的受精效率。
[0018] 本申請的其它特征和優點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變 得顯而易見，或者通過實施本申請而了解。本申請的目的和其他優點可通過在說明書、權利 要求書W及附圖中所特別指出的結構來實現和獲得。
【附圖說明】
[0019] 附圖用來提供對本申請技術方案的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本 申請的實施例一起用于解釋本申請的技術方案，并不構成對本申請技術方案的限制。
[0020] 圖1示出改造后的pLAT52:AtMDISl-N0ST載體。
[0021] 圖2示出用PCR方法進行轉基因植物陽性苗的鑒定結果。pLM'SSiAtMDISl-NOST轉 入近緣物種化psella rubella后，其中擬南芥基因 AtMDISl的表達。泳道1為陰性對照(野生 型Capsella rubella植株的PCR擴增產物），泳道2和3為WT1代不同株的陽性轉基因植物 (表達AtMDISl的C. rubel la植物）的基因組DNA為模板的PCR擴增產物。如圖中箭頭所示，較 大的條帶為野生型化psella rubella中的CrMDISUAtMDUl的直系同源基因），較小的條帶 為轉入的擬南芥的AtMDISl。
[0022] 圖3示出AtMDISl轉基因陽性化psella rubella植物花粉半體外萌發導向未受精 擬南芥胚珠。左圖：表達擬南芥的AtMDUl基因的化psella rubella的花粉管識別并進入未 受精的成熟擬南芥胚珠;右圖：野生型Capsella rubella的花粉管不能被成熟的未受精擬 南芥胚珠所吸引，花粉管在珠孔附近經過而未進入珠孔。
[0023] 圖4為野生型W及轉基因化psel la rubel la植物的花粉管被成熟的未受精擬南芥 胚珠吸引的效率統計。圖中誤差線為Ξ次重復的標準差，統計學分析使用Student ' S t-test方法，p***<0.01表示差異極顯著。星號顯示有統計學上的顯著差異。
【具體實施方式】
[0024] 下面將W實施例的方式對本申請作進一步的詳細描述，W使本領域技術人員能夠 實踐本申請。應當理解，可W采用其他實施方式，并且可W做出適當的改變而不偏離本申請 的精神或范圍。為了避免對于使本領域技術人員能夠實踐本申請來說不必要的細節，說明 書可能省略了對于本領域技術人員來說已知的某些信息。因此，W下詳細描述不應W限制 性的意義來理解，且本發明的范圍僅由所附權利要求界定。
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0026] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027] W下實施例便于更好地理解本申請，但并不限定本申請的范圍。
[0028] 本申請列舉的實施例中進行基因編輯時使用的具體工具如下：
[00巧]擬南芥Col-〇生態型（Arabidopsis thaliana L.)在文獻^in-Ran Li ,Hong-Ju Li,Li Yuan,Man Liu,Dong-Qiao Shi ,Jie Liu and Wei-Cai Yang.(2014)Arabidopsis DAYU/ABERRANT PEROXISOME M0RPH0L0GY9Is a Key Regulator of Peroxisome Biogenesis and Plays Critical Roles during Pollen Maturation and Germination in Planta.化e Plant Cell ,26:619-635/'中描述，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物 學研究所獲得。
[0030] C.rubellaKapsella rubella)種子在ABRC stock centrer獲得。
[0031] DNA內切酶購自化w England Biolabs公司；DNA回收試劑盒購自天根生化科技有 限公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；T0Y0B0K0D Plus酶購自東洋紡生物科技有限公司。
[0032] LAT52啟動子由McCormick S.實驗室在番茄中分離出來，是可W驅動基因在花粉、 萌發中的花粉管中表達的啟動子。在文獻"Muschietti J,Di;rcks L,Vancanneyt G, McCormick S.(1994)LAT52 protein is essential for tomato pollen development: pollen expressi