一種胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學中糖工程領域，設及胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因的第 1405和1406位核巧酸的特異性突變，多膚及蛋白快速簡易葡萄糖基化的酶合成方法。
【背景技術】
[0002] 胸膜肺炎放線桿菌在1957年首次報道，早稱為副溶血嗜血桿菌，1964年被正式宣 布為豬胸膜肺炎的病原體，1983年重新分類后，DNA的研究顯示它與林氏放線桿菌更密切相 關。屬于己氏桿菌科，放線菌屬，是一種革蘭氏陰性多形態小球桿菌，兼性厭氧，有芙膜，鞭 毛和菌毛，不能形成芽抱，是一種呼吸道寄生菌，主要存在于患病動物的肺部和扁桃體，病 豬和帶菌豬是本病的主要傳染源。
[0003] 糖蛋白在生命活動中扮演著重要的角色，如細胞信號識別、神經調控、細胞間的信 息傳達及免疫調節等，因此引起了人們的廣泛關注。糖膚是位于糖蛋白核屯、結構區域的由 糖基與氨基酸或多膚鏈W共價鍵相連而形成的綴合物。含有糖膚的物質與糖蛋白相比，具 有多種相似的重要生物功能，同時又沒有糖蛋白巨大的分子量和復雜的結構，因此成為研 究糖蛋白的重要模型。而且糖膚類藥物研究非常廣泛，糖膚類藥物主要用于治療癌癥、代謝 素亂相關的重大疾病，運些疾病相關的藥物擁有全球非常重要的市場。蛋白糖基化修飾一 共有5種類型，按重要性排序分別是N- 0- P- C-和G-糖基化，運些糖基化修飾均通過 連接寡糖基團到蛋白表面，但其修飾位點不同，其中WN-糖基化最為普遍，其通過將聚糖連 接到天冬氨酸或精氨酸側鏈的氮原子上對蛋白進行修飾，是目前研究的最為透徹的糖基化 過程。
[0004] -直W來，大部分藥物糖蛋白依賴于直接從生物體中提取，但因為數量有限成本 高昂存在病毒感染等問題，無法廣泛運用于臨床。因此，目前的研究主要集中在開發糖蛋白 表達載體，經過適當的糖基化改造，用于藥用蛋白質的生產。ApNGT就屬于N-糖基化修飾的 一種重要的轉移酶。
【發明內容】
[000引本發明公開了一種胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其特征在于，所述ApNGT突變 基因的突變位點在于所述ApNGT基因從5/端起第1405個核巧酸，突變結果為C到G，第1406 個核巧酸，突變結果為A到C，所述的ApNGT基因序列見SEQ NO: 1。其編碼的氨基酸突變位點 第620個氨基酸，突變結果是由Glutamine到Alanine，序列見SEQ NO: 2。
[0006] 本發明所述胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其中的引物SEQ NO : 3 CATTTCCATTTTGCATTGGGGGCATCAAACGGTATTAC為特異擴增胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因 的上游引物；SEQ NO:4 GCCCCCAATGCAAAATGGAAATGCACTTTCACTTTG為胸膜肺炎放線桿菌的 ApNGT基因的下游引物。
[0007] 本發明所述胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因，其中1)包含N-X-SA序列的多膚進行 糖基化修飾，反應為體系 30ul，包含抑=8.0Tris-肥 l(50mM)，MgCl2(5mM)，UDP-Glc(l〇mM)， NaCl (lOmM)，ApNGT(0.3mg/ml)，Peptide( ImM)，用d地2〇補齊，37°C 水浴條件下反應45分 鐘，采用MLDI-TOF定性和HPLC定量； 2)在包含N-X-S/T序列的蛋白hmwlct(NCBI: Accession : WI^_014550671.1GI: 504363569，AtaC1866-2428)進行糖基化修飾，反應體系為200ul，包含pH=8.0Tris-HCl (50mM)，MgCl2(5mM)，UDP-Glc(5mM)，rfeCl(100mM)，ApNGT(0.3mg/ml)，Protein(lmg/ml)， 37°C反應一個小時，使用MLDI-TOF定性。
[0008] 本發明進一步公開了胸膜肺炎放線桿菌ApNGT基因在制備提高糖基化多膚的效率 方面的應用。實驗結果表明：本發明提供的胸膜肺炎放線桿菌ApNGT基因（改造型酶），可W 大量提高糖基化多膚的效率，可W實現體外多膚糖基化，通過綠色環保，簡易的操作可W大 量獲得糖基化多膚，突破了現有化學方法合成糖膚步驟繁多，成本高昂，選擇性差的屏障。 同時突變的ApNGT在大腸桿菌中表達后，在多膚水平上糖基化效率與野生型的ApNGT相比提 高了 160多倍，運為多膚類和蛋白類生物制品糖基化修飾提供了極大便利。突變后ApNGT穩 定性良好，可作為一種工具酶易于商品化生產，具有廣泛的應用前景。
[0009] 本發明所述S E Q N 0 : 1的原始基因序列 過tgg過過過過eg過過過過t過過過ccg過過tgt過get過過ttttg過過gcggcggttgcggct過過過g過tt過tg過過過過過gcttgctc cgaattacttttaattttgagtcagttagatagtaactttggtggtattcatgagattgagtttgaatatccggcgc agcttcaggatttagagcaagaaaaaatcgtttatttttgtacgcgtatggcaacggcgattactacgttgttttcc gatcctgtcttagaaatctccgatttaggcgttcagagatttttggtttatcaacgttggttagcgttaatctttgc c過gttc過ccgtttgtg過過tgegg過tc過t過t過tt過c過過過c過t過t過過c過g過g過geeg過過tegt過過g過過t過gttt過g過g過 ttcatttagattcttcaaaatcgtcattaattaaattctgtatcctgtatttaccggaatctaacgtaaatttgaat ctggatgtaatgtggaatatttcacctgaattatgcgcttctttatgttttgctttgcaatcgcctcgttttgtcgg tacatcaactgcgtttaataaacgagcgaccattttgcaatggtttccacgacatttggatcaacttaaaaacctga 過t過過t過ttcct過gtgee過tttege過tg過cgt過t過t過tgc過ttgt過gtt過tg過t過cgtc過gt過過過t過過過c過tg過tgtg 過過過過gggcgtt過過過tc過tgtt過ttcgtcgcc過t過teg過過過gtg過過t過cggttgg過過過g過tegtg過tgtcgctc過t過t cggttatcgtaataataaaccggttatggtcgtattactggaacatttccattcggcccattctatttaccgtacgc attccacatctatgattgcggcacgtgaacatttctatttaatcggtttaggtagtccgtcggttgatcaagcgggt c過過g過ggtttttg過tg過gttcc過cttggttgccggcg過t過過t過tg過過gc過g過過gtt過g過過ttt過tccgctc過gtttg tg過g過gc過過cggtgccgc過過t過tttt過t過tgccg過gt過teggt過tgg過t過tg過eg過eg過ttttcgc過過gt過過t過ege gccttgctccg過t過c過過geg過t過gc過ttggggc過teegge過過c過過c過c過ttegg過ette過ttg過過t過tgtg過ttgtg g過過g過eg過tt過tgteggetegg過過g過gtgcttt過geg過過過cgtt過tt過cgttt過cc過過過過g過tgcgctgcctt過cgt cccgtc過gc過tt過gcgcctg過過過過過gtgg過ct過ttt過tt過cgtg過過過過teegg過過gtggt過過過t過teggt過t過gett c過過cc過eg過tg過過get過過過teegt過tttett過g過過gegtt過過過過geg過ttcgtg過tegtgee過過過gtg過過過gtgc過t ttccattttgcattggggcaatcaaacggtattactcacccgtatgtagaacgctttattaaatcttatttaggtga ttcggccactgcgcaccctcattctccttatcatcaatatctccgtattttgcataattgcgatatgatggtaaacc cgttccc過ttcggg過過t過eg過過egg過過tt過teg過t過tggtc過ettt過ggett過gttggtgtgtgt過過g過c過gg過gee g過過gttc過tg過gc過t過ttg過tg過過g打ggctgttt過過過cgttt過ggett過cccg過gtggctg過t過gc過過過t過eggt過g 過tg過過t過tgttg過過cgggcggttcgctt過gegg過過過過tc過tc過gg過gcgttt過g過gtt過egteg過t過t過tt過ttg過過 過過t過過egg過ttg過過c過c過ttgttt過ccgggg過tcct過g過ccg過tggg過c過過gt過ttttt過g過過過過過tt過過過tgcgtt cct過過過過g過過過過tt過過 沈Q NO: 2的原始氨基酸序列ME肥NKPNVAN陽AAVAA邸YEKACS化化ILSQLDSNFGGmEIE陽Υ PA化QDLE犯KIVYFCTRMATAITTLFSDPVLEISDLGVQRFLVYQRWLALIFASSPFVNA畑ILQTYNREPNRKNS LEIHLDSSKSSLIKFCILYLPESNVNLNLDVMWNISP化CA化CFALQSPRFVGTSTAFNKRATILQWFPRHLDQLK 化順 IPSAI 甜 DVYM 肥 SYDTSVNKHDVKRALNHVIR 畑 IE 沈 YGW 邸畑 VAHIGYRNNKPVMV 化 LEHF 服 AHSIY RTHSTSMIAAREHFYLIGLGSPSVDQAG 犯 V 抑邸 HLVAGDNMKQKL 邸 IRSVCESNGAAIFYMPSIGMDMTTIFAS NTRLAPIQAIALGHPATT服DFIEYVIVEDDYVGS邸CF沈TLLRLP邸ALPYVPSALAP邸VD化LRENPEVVNIG IASTTMKLNPY化EALKAI畑RAKVKVHFHFALGQSNG口HPYV邸FIKS化GDSATAHPHSPYHQYLRILHNCDMM VNPFPFGNTNGHDMVTLGLVGVCKTGAEVHEHIDEGLFKRLGUEWLIANTVDEYVERAVRLAENHQERLELRRYI 巧NNGLNTLFTGDPRPMGQVFLEKLNAFLKEN 本發明公開的胸膜肺炎放線桿菌的ApNGT基因的優點在于： 1.多膚葡萄糖基化效率提升了 100多倍。
[0010] 我們已經通過MALDI-T0F檢測氨基酸序列為GGFNLTYTIER的多膚底物可W被野生 型和改造型NGT糖基化，因而實驗設計了帶巧光標簽的該多膚，具體為FITC-GGraLTYTI邸， 通過對兩個酶的動力學參數的測定，從數據中我們可W得到改造型酶Q469A多膚葡萄糖基 化效率提升160倍左右。
[0011] 大量獲得葡萄糖基化的多膚和糖蛋白的簡易程序。
[0012] 現階段的糖膚合成主要靠化學合成方法，主要有直線型合成法，匯聚式合成法，直 線-匯聚混合法，自然連