一種紫花苜蓿對羥基苯丙酮酸雙加氧酶基因及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學領域，特別是設及一種紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶 基因 MsHPPD及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 維生素 E是一種脂溶性的維生素，天然產物依疏水性尾端的飽和度和芳香環上甲 基數目和位置的不同分為八種類型，分別是3、β、丫、σ-生育酪和3、β、丫、σ-生育Ξ締酪，其 中a-生育酪的生物活性最高。
[0003] 維生素 E是人體必需的微量營養物質，而人體不能自身合成，只能通過飲食攝入。 研究表明維生素 E可W提高動物體的免疫力。相關研究表明，補飼維生素 E的家畜其肉質要 優于正常飼養的家畜。而且可W提高肉和奶的質量，延長保鮮期。維生素 E具有抗氧化作用。 維生素 E的主要作用是清除活性氧，保護多不飽和脂肪酸不被氧化。對于動植物都有重要作 用。此外，維生素 E還在植物的抗逆性調控中發揮作用。
[0004] 紫花首猜是重要豆科牧草，也是全國乃至世界上種植最多的牧草品種.由于其適 應性廣、產量高、品質好等優點，素有"牧草之王"之美譽。隨著我國畜牧業的發展，對牧草品 質的要求也不斷提高。維生素 E能夠提高動物肉質的保鮮程度，延長上架時間，提高動物的 生育能力，還具有抗氧化、抗逆的作用，在牧草品質改良方面具有很好的利用價值。但紫花 首猜屬于異花授粉的四倍體豆科牧草，其遺傳轉化困難，生長周期長，基因功能的研究比較 滯后，到目前為止，對紫花首猜維生素 E合成相關基因的研究還處于空白。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因 MsHPPD,本發明 為進一步研究紫花首猜MsHPPD基因的功能，W及MsHPPD基因改良牧草品質，特別是分子改 良牧草維生素 E含量的應用奠定基礎。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因的制備方 法。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種上述紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因在提 高擬南芥中的維生素 E含量和抗逆性調控中的應用。
[000引本發明所采用的第一技術方案是，一種紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因， 其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本發明所采用的第二技術方案是，一種紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因的 制備方法，具體按照W下步驟實施：
[0010] 步驟1、采用化izol試劑法提取紫花首猜總RNA;
[00川步驟2、對步驟1中提取的紫花首猜總RNA進行RACE克隆cDNA全長，并對PCR進行膠 回收;所述RACE引物包括GSP1和GSP2，其中，GSP1的序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示，具體 為：5 ' -ATGGCACCGTTGTTTACGCTGGTGGTG-3 ' ； GSP2的序列如序列表中 SEQID NO: 5所示，具體 為：5 '-GACGCCGAACTGGCTTTCACCACC-3 '。
[001。步驟3、構建PCR產物的重組質粒，并轉化大腸桿菌畑5α感受態細胞，得到菌液；
[0013] 步驟4、對得到的菌液進行PCR檢測，挑選陽性菌液，送Invitrogen公司進行測序， 將測序結果進行拼接，得到紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因 cDNA全長序列，紫花首 猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 本發明所采用的第Ξ技術方案是，一種上述的紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶 基因在提高擬南芥維生素 E含量和抗逆性調控中的應用。
[0015] 本發明的有益效果是:本發明基于對紫花首猜中品質形成的生物學機制的研究， 一方面提供了紫花首猜MsHPPD基因及該基因編碼的蛋白，另一方面還提供了含有所述首猜 MsHPPD基因的表達載體和細胞，W及培育維生素 E含量提高的擬南芥的方法，還提供了它們 的應用。
[0016] 本發明對了解HPPD基因在牧草品質和抗逆性調控中的作用，對牧草品質分子改良 具有非常重要的意義。本發明提供的紫花首猜MsHPPD基因在擬南芥中的增強表達可W顯著 提高擬南芥維生素 E的含量。本發明的重要應用前景在于:該基因的發現為提高主要牧草植 物(特別是豆科植物，如紫花首猜）中維生素 E提供了基因資源，在基因工程改良牧草的研究 中，特別是品質改良的轉基因新種質創制中發揮重要作用。
[0017] 下面結合附圖對本發明作進一步說明。
【附圖說明】
[0018] 圖1是對紫花首猜植株進行農桿菌介導的MsHPPD基因同源轉化所用的插入有 MsHPPD基因的PPBI121載體的結構圖；
[0019] 圖2是轉MsHPPD基因的擬南芥株系化1，L2，L3)與空載體對照株系（CK)中維生素 E 含量的比較分析結果圖。
[0020] 圖3為本發明實施例4中輔氨酸含量測定的結果圖；
[0021 ]圖4為本發明實施例4中過氧化物酶(POD)活性測定的結果圖。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1紫花首猜對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因 MsHPPD的制備
[0023] 本發明提供的紫花首猜MsHPPD基因是通過W下方法篩選得到的：
[0024] 通過BLAST對比分析，根據截形首猜中已經克隆的對徑基苯丙酬酸雙加氧酶基因 (Genbank登記號為：XM_003617343 )保守域設計引物（RT-PCR引物為：F: 5 此八(：1'1'1'(：1'此6〔41'此4(：1'了61'1'1'(：-3'，其核巧酸序列如序列表中569 10^:2所示；1?:5'-CCTCAATGTCCTAAATATATCCTCAG-3'，其核巧酸序列如序列表中沈Q ID ^:3所示）。從紫花首 猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.l，中首一號，北京中畜東方草業科技有限責任公 司）中進行擴增，回收預期大小為6(K)bp的片段(跑電泳后回收此長度的片段），將回收的片 段連入PMD18-T Vector(化kara)，測序結果在NCBI的非冗余蛋白數據庫中進行BLASTx分 析，獲得了 一段與已公布的近源物種冊PD基因高度同源的cDNA序列。利用SMARTer? race cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分別對該序列進行5'RACE和3'RACE克隆，最后獲 得了該基因全長序列（核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示）。其中，基因克隆的方法為 分子生物學領域的常規實驗操作，具體方法如下：
[0025] 1、紫花首猜總RNA的提取：
[0026] 紫花首猜總RNA的提取采用Trizol試劑法，具體步驟如下：
[0027] (1)將0.3g左右紫花首猜組織材料加入大約3000μ1化izol試劑，加入液氮快速磨 碎，放在無菌環境中直至變為勻漿。
[00%] (2)用移液槍吸取大約ImL勻漿到1.5mL Eppendorf離屯、管中，劇烈振蕩混勻，于室 溫放置 5min，4°C，13，000巧m 離屯、1 Omin。
[00巧](3)取上清，加入200化氯仿，劇烈振蕩，室溫放置2-3111111，4。0，13,000巧111離屯、 15min。
[0030] (4)溶液從下到上依次分為Ξ層：有機相、蛋白質、無色水相；取上層移入新 Eppendorf離屯、管，加等體積氯仿，重復第3步。
[0031] (5)取其上清加入等體積異丙醇，混合混勻，室溫放置lOmin左右，4°C，13，00化pm 離屯、1 Omin，得到白色RNA沉淀。
[0032] (6)棄上清，加 ΙΟΟΟμΙ 75% 乙醇（用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙 醋)水配制），將沉淀沖起，于4°C，13000巧m離屯、lOmin，倒掉乙醇，留下沉淀。
[0033] (7)重復第6步，在無菌環境下驚干。加 20~50μ1無菌DEPC水溶解。
[0034] 進行RNA電泳，檢測RNA提取質量，IMPLEN微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。
[0035] 2、34〔6克隆基因〇0臟全長
[0036] RACE-ready cDNA的合成
[0037] (1)準備緩沖液：2.0μ1 5X 第一鏈緩沖液（First-S 化 and Buffer)，1.0yl DTT (20πιΜ)，1.0μ1 dNTP Mix(lOmM);
[003引 （2)制備用于5'^〔6的。0臟反應液：2.7扣13酷，1.0415'-〔08?'山6'4，制備用 于3'34〔6的。0臟反應液：3.7化11?酷，1.0413'-〔08口'山6'八；
[0039] (3)將步驟(2)中制備好的液體混勻，短暫離屯、，72°C解育3分鐘，再于42°C冷卻2分 鐘，短暫離屯、收集反應液液體；
[0040] (4)向5'RACE的cDNA反應液中加入化1的SMARTer IIA oligo,短暫離屯、收集液體； [0041 ] (5)制備5'RACE和3'RACE-Ready cDNA反應液(Master Μ?χ):4.0μ1 步驟（1)中得到 的緩沖液，0.2扣1 RNA酶抑制劑(4〇υ/μ1)，1.0μ1 SMARTScribe逆轉錄酶（100U)，將W上試 劑混勻；
[0042] (6)向步驟(3)中得到的3 ' RACE和步驟(4)中得到的5 ' RACE反應液中分別加入5.25 μ1步驟(5)中得到的反應液，輕柔混合，短暫離屯、收集液體