調控順式反應元件GT-1的水稻轉錄因子OsGTBP及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物基因工程技術領域，具體設及調控病原誘導元件GT-1的轉錄因子 OsGTBP及其在水稻改良提高對白葉枯病和紋枯病抗性及抗旱中的應用。
【背景技術】
[0002] 植物在進化過程中形成了組成型和誘導型的防御系統來抵御病原菌的侵染。其中 誘導型系統受兩類基因的控制:抗病基因和抗病相關基因。大多數的抗病基因是小種特異 的，并且其產物能夠識別病原菌分泌的激發子。抗病相關基因能夠起始導致防衛反應的信 號轉導并且大部分抗病相關基因是小種非特異的。
[0003] 到目前為止，在不同植物中已經鑒定了大量抗病相關基因的啟動子。在運些啟動 子中，有一些順式作用元件是抗病相關基因響應生物脅迫所必需的，比如研究較為透徹的 病原誘導元件GCC-盒和W-盒（Chakravarthy et al.,2003;Laloi et al.,2004)eGCC-盒通 常存在于抗病相關基因的啟動子中，比如巧RE(AGACCGCC)能夠指導萊莉酸和激發子響應表 達（Rushton et al.,2002)，S-盒(AGCCACC)被證明能夠調控基因響應真菌激發子表達 化irsch et al.，2000)eW-盒是主要一類受病原誘導的元件，除此之外，在不同植物抗病相 關基因的啟動子中還鑒定到了其它一些病原誘導元件，擬南芥系統獲得抗性轉錄組學研究 已經證明W-盒的重要性(Maleck et al.,2000;Petersen et 曰1.,2000)。如E-盒(Griming and Mate;rn,1997)、GT-l(F*ark et al.,2004)、RAV-盒(Xee et al.,2007)及UPT-盒（Romer et al. ,2010)等。
[0004] 轉錄因子與作用元件的互作是調控植物基因響應病原侵染關鍵的一步。在不同植 物中，防衛相關的轉錄因子及其結合的作用元件是比較保守的。在防衛反應中發揮作用的 轉錄因子主要包括W服Y，ERF，bZIP和MYB(Zhang et al.，2014;Zhu et al.，2014;Fountain et al.,2015;化raheem et al.,2015)eW服Y轉錄因子參與調控多種生理過程，包括防衛反 應，W-盒是已知的WRKY蛋白結合位點巧ulgem et al.，2000)eERF轉錄因子主要調控受乙締 誘導PR基因的表達，其特異結合GCC-盒（Oiiate:-Sdndie.z'and Singh,2002;Dong et al., 2015;Wang et al.，2015)ebZIP轉錄因子廣泛存在于不同植物中，其中一些已被證明可W 通過結合到PR基因啟動子的as-1元件來參與防御機制（Jakoby et al. ,2002)。大多數的 MYB轉錄因子在擬南芥中已被深入研究，并且其中一些通過ΑΒΑ信號途徑來調控抗病反應 (Dubos et al.,2010)。
[0005] 水稻白葉枯病和水稻紋枯病是水稻兩大類病害。在水稻中已鑒定了 37個白葉枯病 抗病基因 （Zhang and Wang,2013)和大量的抗病相關基因。通過改變某些轉錄因子的表達 能夠顯著影響水稻對白葉枯菌的抗性，如OsW服Y13(Qiu et al.，2007)，0sWRKY71(Liu et al.，2007)，0sW服Y45(Qiu and 化，2009)和0sC3H12(Deng et al.，2012)。與白葉枯病抗性 研究相比，有限的研究表明紋枯病抗性是受微效QTLs控制（Wang et al.，2012;Zuo et al. ,2013)，一些抗病相關基因已被證明能夠參與紋枯病抗性，如0sACS2化elliwell et al.，2013)，0sGTBP(Li et al.，2013)和Os巧RFl^an et al.，2013)。
[0006] 水稻是世界上重要的糧食作物，但紋枯病常常造成其產量和品質的下降。因此了 解紋枯病的發病機制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發生，減少或 避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關基因是對水稻抗病機理研究的前提。同時， 與抗病基因的應用相比，抗病相關基因的應用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過超 量表達抗病相關基因進行水稻品種的改良，將進一步增強植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。 運些方面是采用常規植物育種和改良技術所不能達到的。因此如何利用水稻抗病相關基因 的克隆獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。
[0007] 同時干旱天氣也是水稻生產的大敵，如何獲高耐旱的水稻植株也是需要解決的問 題之一。
【發明內容】
[0008] 本發明的發明人針對上述現有技術的情況，提供了一個新的調控病原誘導元件 GT-1的轉錄因子OsGTBP的功能驗證和應用，利用強啟動子驅動和基于RNA干擾原理的轉基 因技術，將OsGTBP基因的超量表達載體和RNAi載體轉入水稻品種中花11，超量及抑制水稻 中OsGTBP基因的表達。OsGTBP基因表達量顯著提高的遺傳轉化水稻對白葉枯病菌和紋枯病 菌的抗性明顯增強，表達量顯著降低的遺傳轉化水稻對白葉枯病菌和紋枯病菌的抗性明顯 減弱，證明OsGTBP基因在水稻抗白葉枯病和紋枯病中發揮重要作用；同時OsGTBP基因表達 量顯著提高的遺傳轉化水稻對干旱的耐受性明顯增強，表達量顯著降低的遺傳轉化水稻對 干旱的耐受性明顯減弱，證明OsGTBP基因在水稻抗旱中也發揮重要作用。
[0009] 發明人首先提供了一種調控病原誘導元件GT-1水稻轉錄因子OsGTBP,其核巧酸序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 其中GT-1元件能夠被下香假單胞桿菌誘導表達(Park et al. ,2004)，是一個病原 誘導元件，本發明針對該元件進行了深入研究，獲得了上述成果。
[0011] 該基因片段為編碼調控病原誘導元件的轉錄因子基因 OsGTBP完整編碼區段的DNA 片段，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
[0012] 獲得了運一基因之后，將運一序列與合適的載體連接，即可獲得可轉入植物細胞 的表達載體，該載體中插入了核巧酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的基因；
[001引其中在本發明的一個優選實施例中，上述選用的表達載體為pCXUN-Myc，該載體通 過化iqui tin啟動子驅動目的基因高效穩定的表達，在基因功能研究中是一個常用表達載 體。
[0014] 利用上述技術獲得的表達載體，可將目的基因轉入目標植物后可產生轉基因植 物，結果發現OsGTBP基因表達量顯著提高的遺傳轉化水稻對白葉枯病菌和紋枯病菌的抗性 及對干旱的耐受性明顯增強，證明OsGTBP基因在水稻抗白葉枯病和紋枯病及干旱中發揮重 要作用，因此證實了超量表達該基因后可W賦予植物對由白葉枯病、紋枯病及干旱產生抗 性反應，獲得高抗病及抗旱植株。
[0015] 該基因片段來源于水稻IRBB13,其通過特殊設計的引物擴增水稻IRBB13CDNA獲 得，其中所述的引物包括引物1，5/ -ATGGCCTCGCCGTCATA-3/其序列如序列表SEQ ID NO. 3所 示，引物2，5' -TCACTCAGTGACATATGTCTTGATC-3'其序列如序列表沈Q ID NO. 4所示，之后利 用強啟動子驅動和基于RNA干擾(RNA interference,RNAi)原理的轉基因技術，將OsGTBP基 因的超量表達載體和抑制表達載體轉入水稻品種中花11，〇sGTBP基因表達量顯著提高的遺 傳轉化水稻對白葉枯病菌、紋枯病菌及干旱的抗性明顯增強，OsGTBP基因表達量顯著降低 的遺傳轉化水稻對白葉枯病菌、紋枯病菌及干旱的抗性明顯減弱，證明OsGTBP基因在水稻 抗白葉枯病、紋枯病及抗旱中發揮重要作用，特別是OsGTBP基因在水稻抗旱中的相關應用 具有突破性的貢獻，可W大大緩解天氣對于水稻產量的影響。
[0016] 之所W采用上述的方法，主要是由于將克隆的抗病相關基因轉入感病的植物，有 助于產生新的抗病植物。特別是可W用遺傳轉化技術在植物中累加多個抗性基因，而不會 產生傳統育種技術中伴隨出現的連鎖基因組序列。而抗病相關基因的克隆是克服傳統