因的cDNA克隆 及其正義、反義表達載體的構建;石樂義，李洪清，李美茹，陳貽竹;植物生理學通訊，2005 年，第41卷，第5期構建而得)分別進行雙酶切，37°C酶切6小時，酶切后分別回收目標片段和 載體片段，用T4連接酶(NEB公司）16°C連接過夜，連接體系為：T4連接酶lul，10 X buff er lul，GF14e基因片段4ul(51ng)，P冊SN載體化L(50ng)，滅菌水化!^;
[0024] (4)、取全部連接產物，用電擊法轉化到大腸桿菌DH5a中，轉化產物涂布卡那霉素 抗性的LB固體培養基。37°C培養過夜，挑6個陽性白色單克隆進行提取質粒，酶切鑒定，選擇 兩個陽性克隆進行測序。測序結果表明：該序列全長1268個堿基，包含一個開放閱讀框，即 為GF14e基因，其大小為789個堿基，其核巧酸序列如SEQ ID No: 1所示，其編碼蛋白具有262 個氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0025] 實施例2 GF14e基因在轉基因植株中的過表達效果鑒定
[0026] 采用農桿菌邸A105介導的遺傳轉化方法將過表達載體轉入正常梗稻品種日本晴 中。轉化原代(To代)通過PCR及定量PCR檢測，從DNA水平和RNA水平鑒定陽性轉化植株，證明 目標基因 GF14e已經轉化入水稻中，并且實現目標基因 GF14e的表達量提高。
[0027] 在受控的溫室中把轉基因陽性植株自交得到純合陽性轉基因1代(Τι代)株系，每 個株系選擇10株經PCR檢測為陽性的植株繁種，得到Τ2代植株，Τ2代株系再進行PCR檢測，找 到來源于不同To代植株的Τ2代純合株系3個(5-1、12-1、12-2)。對3個株系的幼苗葉片進行巧 光定量PCR，檢測目標基因 GF14e的表達量，W野生型結果為對照。
[002引巧光定量PCR鑒定GF14e基因在轉基因植株中過表達效果程序如下：
[0029] 1、取PCR檢測陽性的轉基因植株始穗期的小穗進行總RNA提取，采用的試劑為 TriZol ReagentQnvitrogen公司，其貨號為：15596026)，根據該試劑的說明書的步驟進 行，并用甲醒變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量；
[0030] 2、取化g的總RNA做起始逆轉錄反應，所采用的逆轉錄酶為PrimeScript (化kara公 司），逆轉錄反應的步驟參考該逆轉錄酶的使用說明。W逆轉錄產物為模板，采用引物 GF14eF和GF14eR引物對檢ilGF14e基因的表達情況；引物序列如下：GF14eF， GATATTGCCCTGGCAGAGTTG(SEQIDNo:5);GF14eR，GAGATATCGGAAGTCCACAGC(WQIDNo:6); [00川 3、采用水稻管家基因 EFla基因的EFlaF和E門aR引物對檢測水稻EFla基因的表達 作為內參，定量PCR試劑為SYB民吸Premix Ex Taq?(TAKARA)，定量PCR儀器為CFX 96 (BioRAD公司），
[0032] EFlaF，TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT(沈Q ID No:7);
[0033] EFlaR,GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA(SEQ ID No：8)〇
[0034] 3個轉基因純合株系（5-1、12-1、12-2)和野生型植株中6。146的相對1111?^4表達水平 結果如圖2所示，圖2結果表明3個株系相對于野生型，GF14e的表達量都大幅度提高10-40 倍。
[0035] 實施例3 GF14e過表達轉基因植株稻攝病穗攝抗性的鑒定
[0036] 把實施例2中純合的3個過表達轉基因 T2代純合株系（5-1、12-1、12-2)和野生型水 稻種子在32°C發芽，2天后將幼芽分別移至裝有泥±的塑料盤中播種，待其長到3葉期時將 幼苗移栽到大型塑料桶中，每桶種4株，每個株系至少種10株。網室中自然生長至抽穗期進 行接種。采用的稻攝病菌株為日本晴敏感的GD08-T13。
[0037] 待稻穗抽出2~8cm左右時，用手播出稻穗，取小片棉花包裹住稻穗的下緣處， 然后吸取2ml的抱子液(lx 106spores/ml)注入到棉花中，棉花外面用錫錐紙包裹W防菌液 蒸發。在網室中，每隔2小時噴水2分鐘，W保證濕度利于抱子萌發。3周后調查發病結果。結 果見圖3所示，圖3結果表明GF14e過表達株穗攝抗性明顯增強，與野生型相比，稻穗主軸的 感病長度明顯減小。
[0038] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種提高水稻穗瘟抗性的基因 GF14e，其特征在于，所述基因具有如SEQ ID No: 1所 示的核苷酸序列。2. -種提尚水稻糖痕抗性的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有如SEQ ID No:2所不的氣 基酸序列。3. 根據權利要求2所述的提高水稻穗瘟抗性的蛋白，其特征在于，所述蛋白由如SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列編碼。4. 權利要求1所述的提高水稻穗瘟抗性的基因 GF14e在提高水稻穗瘟抗性方面的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種提高水稻穗瘟抗性的基因GF14e、蛋白及其應用，所述基因具有如SEQ？ID？No：1所示的核苷酸序列。本發明首次證明了水稻基因GF14e是水稻穗瘟抗性的功能基因，該基因的克隆和生物學功能驗證對于水稻稻瘟病抗性的分子機制研究有重要的參考意義；過表達GF14e基因的水稻轉化過表達載體轉化水稻后能大幅提高GF14e的表達量，伴隨著表達量的提高，轉化植株的稻瘟病穗瘟抗性明顯增強，并且轉基因植株在生長狀態及農藝性狀上沒有明顯的改變。本發明過表達GF14e的技術可以應用于水稻的基因遺傳工程育種，并能夠應用于生產實踐中，改良水稻的稻瘟病抗性，從而保障目前水稻病害頻發的氣候條件下的水稻生產安全。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00, C07K14/415
【公開號】CN105505946
【申請號】CN201510828431
【發明人】劉清, 朱小源, 劉斌, 趙均良, 毛興學, 王曉飛
【申請人】廣東省農業科學院水稻研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月25日