一種巰基蛋白酶的提取方法
【技術領域】
[0001 ]本發明設及一種琉基蛋白酶的提取方法。
【背景技術】
[0002] 木馨淀粉磁性微球是W磁性Fe3〇4及天然高分子物質木馨淀粉為原材料的一種可 生物降解功能材料。目前，國內外研究大多采用合成高分子材料為殼制備高分子磁性微球， 而W天然高分子物質木馨淀粉為原材料，相對于合成高分子材料具有可降解性、無毒性、生 物相容性、環境友好且來源豐富等特點。高分子磁性微球既具有高分子的特性，可通過交 聯、共聚、接枝、表面改性等賦予其多種性能。高分子磁性微球又因具有磁響應性，在外加磁 場作用下可迅速分離，且操作簡便，至今，在生物分離如細胞分離、標記、核酸排序等，生物 醫學如祀向給藥、臨床診斷，和生物工程如作為載體酶的固定化等方面得到快速的發展。近 年來，磁性高分子微球的特殊性能和其顯示的廣闊應用前景受到人們的廣泛關注，使得高 分子磁性微球在多個領域顯示出強大的生命力，已滲透到分離工程等許多領域。
[0003] 琉基蛋白酶是指一類活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并且依靠琉基催化水解膚鍵 的蛋白水解酶，包括溶菌酶、渡蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶等。W木瓜蛋白酶為例，其可水解多 膚中賴氨酸、精氨酸和蛋白質的簇基端，是一種可食用的活性半脫氨酸蛋白酶。它具有天 然、衛生安全、酶活高且熱穩定性好等特點，不僅在廣泛應用于食品、飼料、日化等方面，在 醫藥、皮革及紡織等行業也有了一定的應用，目前主要應用于肉的嫩化和啤酒的澄清等。木 瓜蛋白酶主要存在于番木瓜的根、莖、葉和果實中，其含量在未成熟的乳汁中最豐富。由于 木瓜蛋白酶為天然產物，如何從植物中更快更好的分離成為科研工作者們的研究熱點。
[0004] 目前提取木瓜蛋白酶的技術多樣，主要包括親和層析法、超濾法、有機溶劑法、鹽 析法、絮凝法和噴霧干燥法等。親和層析法分離得到的酶純度高，但前處理液需進行初步純 化，且層析法操作過程繁瑣，不易進行工業化生產;超濾法因木瓜蛋白酶為大分子物質，在 超濾過程中易聚積在膜表面，產生濃差極化現象，導致超濾速率下降；有機溶劑法程序復 雜，過程采用了大量的機物質，易產生有機溶劑殘留和木瓜蛋白酶易變性等問題;鹽析法使 用大量的鹽，產生較大灰分，易使酶變性，得到產品的活性較低;絮凝法由于其專一性不強， 分離得到的木瓜蛋白酶含較多雜質，純度不高;噴霧干燥法易發生木瓜蛋白酶粘結在容器 壁導致活性降低等問題。
[0005] 文獻《功能納米顆粒對木瓜蛋白酶吸附動力學及熱力學研究》報道利用殼聚糖磁 性微球吸附分離木瓜蛋白酶，但是其對木瓜蛋白酶的平衡吸附量較低。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中琉基蛋白酶分離過程復雜，步 驟繁多，而提供了一種琉基蛋白酶的提取方法。本發明的分離方法操作簡單，時間短，設備 要求簡單，且平衡吸附量較高。
[0007] 發明人經過試驗創造性地發現將木馨淀粉磁性微球應用于琉基蛋白酶的吸附分 離，運用磁性分離技術，在短時間內實現快速分離，可將許多煩瑣復雜的操作簡單化，使傳 統測試的周期大大縮短。
[0008] 本發明提供了一種琉基蛋白酶的提取方法，其包括W下步驟：（1)將木馨淀粉磁性 微球，與含有琉基蛋白酶的溶液混合后進行振蕩吸附；（2)將步驟（1)的反應液進行磁性分 離后，將木馨淀粉磁性微球進行洗脫，即可。
[0009] 本發明所述的琉基蛋白酶是指本領域中的一類活性中屯、含有琉基(半脫氨酸），并 且依靠琉基催化水解膚鍵的蛋白水解酶，一般包括溶菌酶、渡蘿蛋白酶或木瓜蛋白酶等。
[0010] 步驟(1)中，所述的振蕩吸附的方法優選靜態吸附法。所述的振蕩吸附優選采用恒 溫搖床進行振蕩吸附。所述的振蕩吸附的轉速可參照本領域的常規進行選擇，本發明優選 100~2(K)r/min，更優選15化/min。所述的振蕩吸附的溫度可參照本領域的常規進行選擇， 優選20~45°C，更優選25~40°C;進一步優選30~35°C。所述的振蕩吸附的時間可為使所述 的振蕩吸附的吸附量趨于平衡，即可;例如當所述的木馨淀粉磁性微球的用量為〇.2g，琉基 蛋白酶為木瓜蛋白酶，且所述的含木瓜蛋白酶的溶液為20mL，所述的木瓜蛋白酶濃度為 Img/mL時，所述的振蕩吸附的時間優選10~300min，例如：20min、30min、40min、50min、 60min、70min、80min、90min、100min、120min、150min、180min 或 240min，更優選 60min;又如， 當所述的木馨淀粉磁性微球的用量為1.2g，琉基蛋白酶為溶菌酶，且所述的含溶菌酶的溶 液為20mL，所述的溶菌酶濃度為0.5mg/mL時，所述的振蕩吸附的時間優選10~300min，例 女日：20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、lOOmin、120min、ISOmin、 ISOmin 或 240min，更優選 ISOmin。
[0011] 步驟（1)中，所述的木馨淀粉磁性微球的用量可為本領域常規的可將所述的琉基 蛋白酶吸附，即可;本發明中所述的木馨淀粉磁性微球與所述的琉基蛋白酶的質量比優選 2.5:1~12.5:1，更優選5:1~12:1，進一步優選7.5:1~10:1。
[0012] 步驟（1)中，所述的含有琉基蛋白酶溶液優選為將琉基蛋白酶溶于化is-HCl緩沖 液中得到的含有琉基蛋白酶溶液;所述的含有琉基蛋白酶溶液的pH值優選5~10,更優選6 ~9,進一步優選7~8.5,更進一步優選7~8;所述的含有琉基蛋白酶溶液中琉基蛋白酶的 濃度優選0.5~Img/mL。
[0013] 步驟(2)中，所述的洗脫的洗脫液可W為本領域常規的可將琉基蛋白酶從木馨磁 性微球上洗脫下來的洗脫液，本發明優選為：pH為4.5~6.5(更優選pH為5)，且含0.9~ 1. Imol/L(優選1.0mol/L)NaCl的醋酸和醋酸鹽緩沖液;所述的醋酸鹽優選醋酸鋼。
[0014] 木馨淀粉磁性微球吸附含琉基蛋白酶的吸附原理可為:淀粉上裸露的活潑徑基的 親水性，和淀粉對蛋白酶的親和性，木馨淀粉中含有0.07 % -0.09 %的憐，對酶具有親和作 用；淀粉磁性微球中的四氧化Ξ鐵磁性粒子中的鐵帶正電荷，能夠與酶中琉基中孤對電子 產生靜電作用吸附，從而實現了蛋白酶的吸附分離。
[0015] 在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳 實例。
[0016] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0017] 本發明的積極進步效果在于：（1)采用磁性分離技術，實現固液快速分離。木馨淀 粉磁性微球可作為親和吸附材料，通過靜電作用或配位作用與木瓜蛋白酶結合，對木瓜蛋 白酶的吸附率可W達到23.98~47.22%，采用磁性吸附進行快速分離。洗脫得到解吸率為 88.56~91.48%，測得相對酶活為60.21 %~69.7%。（2)利用木馨淀粉磁性微球吸附分離 溶菌酶額的吸附量可為5.87mg/g，吸附率可為73.42%; (3)木馨淀粉磁性微球為環保型吸 附劑，具有無毒、無污染，對環境友好。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0019] 本發明【具體實施方式】部分設及的木馨淀粉磁性微球均參照文獻木馨淀粉磁性微 球的制備及表征，食品科技，2014，39(6)，242-246制備得到。
[0020] 實施例1
[0021] 步驟(1)W木馨淀粉磁性微球為吸附劑，木瓜蛋白酶為模型蛋白，采用靜態吸附法 進行吸