一種菊粉內切酶的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明設及基因工程和發酵工程領域，具體地說，設及一種經基因工程技術優化 后的菊粉內切酶基因經重組大腸桿菌表達后高效制備菊粉內切酶的方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 菊粉是由β-2，1-糖巧鍵連接D-巧喃果糖分子組成的線性直鏈多糖，末端常帶有一 個葡萄糖，聚合度DP通常為2~60之間，通常存在于菊宦，菊芋及雪蓮果等植物的根狀塊莖 中。菊粉酶是能夠水解e-2，i-D-果聚糖果糖巧鍵的一類水解酶類，學名β-2，1-0果聚糖水解 酶巧C 3.2.1)，又稱β-果聚糖酶，2，1-D-果聚糖水解酶。微生物菊粉酶可W催化植物中的菊 糖水解為果糖或低聚果糖。根據其對底物的作用方式不同，菊粉酶分為兩類。一類是外切果 聚糖水解酶巧C3.2.1.8)，又稱外切菊粉酶，外切菊粉酶從菊糖或低聚果糖分子的非還原末 端依次水解0-D果糖巧鍵，生成一分子果糖和少一個果糖分子的果聚糖，最終產物為果糖和 葡萄糖。另一類是內切果聚糖水解酶巧C 3.2.1.7)，又稱內切菊粉酶。內切菊粉酶從菊糖分 子內部隨機切斷β-2，1-巧喃果糖巧鍵，得到6。2、6。3、6。4爪少3少4爪等低聚果糖和短鏈果 聚糖。內切菊粉酶在工業領域用于生產低聚果糖有很大的潛力。
[0003] 應用內切菊粉酶運一催化特性，內切菊粉酶能W菊粉為底物，催化菊粉水解成低 聚果糖。低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，具有重要的健康、藥用開發價 值。制備適合工業化生產的內切菊粉酶是生產低聚果糖技術的關鍵。
[0004] 菊粉內切酶主要分布在微生物中，目前研究較多的產菊粉酶的微生物包括真菌、 酵母和細菌。其中絲狀真菌有17個屬40余種，酵母菌有10個屬20余種，細菌有12個屬10余 種。研究較多的產菊粉酶絲狀真菌主要包括Aspe;rgillus nige;r、Penicilliumsp、raiizopus delemar、Fusarium oxysporum、Talaromyces flavusvar flavus和Chrysosporium pannorum等，其菊粉酶多為胞外酶；酵母主要有Kluyveromyces fragilis、Kluyve;romyces m曰rxi曰nus、Deb曰ryomyces c曰nt曰rellii和S曰cch曰romyces化曰邑1118等，其菊粉酉每多為胞內 酶或與細胞壁相結合；細菌主要有Bacillus subtilis、Ath;robacter sp.、Pseudomonas sp.和Xanthomonas sp.等，其菊粉酶W胞外酶為主。研究表明，大部分微生物分泌的菊粉酶 主要為外切酶，或內外切混合酶。鑒于直接從野生菌中提取內切菊粉酶存在工藝復雜，提取 率低且較難將內外切菊粉酶分開及成本昂貴等問題，尋找廉價、高效的外源基因表達方法 是目前內切菊粉酶的研究熱點。
[0005] 無花果曲霉（Aspergillus ficuum ATCC 16882)具有編碼內切菊粉酶的基因 end〇-inu2。本發明 ^Aspergillus ficuum ATCC 16882的end〇-inu2基因為來源序列，通過 基因工程技術對基因序列進行優化，選用大腸桿菌作為宿主，構建此具有內切菊粉酶活性 的重組大腸桿菌。大腸桿菌遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、易于操作，是表達外 源蛋白的首選體系。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種高效制備菊粉內切酶的方法。
[0007] 本發明采用的技術方案如下：
[000引一種菊粉內切酶的制備方法，該制備方法包括如下步驟：
[0009] 步驟一，構建大腸桿菌工程菌:將經過基因工程技術優化后的編碼菊粉內切酶的 基因序列pelB-NSinu2,插入到大腸桿菌pET28a載體上，構建出祀T28a-pelB-NSinu2質粒， 導入大腸桿菌Escherichia coli化21中，構建出高效分泌表達菊粉內切酶的重組大腸桿 菌E.coli 化21 祀T28a-pelB-NSinu2;
[0010] 步驟二，利用步驟一獲得的大腸桿菌工程菌進行發酵，實現菊粉內切酶的分泌表 達；
[0011] 步驟Ξ，提取發酵上清液，對該上清液進行純化得到菊粉內切酶液。
[0012] 進一步地，步驟一所述的構建大腸桿菌工程菌的具體步驟如下：
[0013] 1)提取無花果曲霉Aspe巧illus ficuum ATCC 16882總DNA;
[0014] 2)設計引物，用PCR方法克隆end〇-inu2基因；
[0015] 3)將上述克隆出來的來源于真核菌株的end〇-inu2基因片段送于南京金斯瑞公司 測序并優化為適用于原核表達體系的基因片段inu2。
[0016] 4)對優化后的基因片段inu2和來自祀T-20b( + )載體的pelB基因運用同源重組方 法設計引物，用PCR方法從inu2基因序列和祀T-20b( + )載體上分別克隆缺少內源信號膚序 列的NSinu2基因及pelBf目號膚基因序列。
[0017] 5)將PCR出來的帶有同源臂序列的pelB片段及NSinu2序列片段與線性化克隆載體 祀T-28a( + )按一定比例混合后，在Exnase ?的催化下，僅需反應3〇min即可進行轉化，完成 定向克隆，構建出將pelB與NSinu2融合表達的重組質粒祀T28a-pelB-NSinu2.
[0018] 6)然后將重組載體祀T28a( + )-pelB-NSinu2轉入大腸桿菌，進行重組克隆篩選，獲 得大腸桿菌工程菌Escherichia coli BL21 祀T28a-pelB-NSinu2。
[0019] 進一步地，步驟二所述發酵的具體步驟如下：
[0020] 1)挑取重組菌單菌落于LB培養基中培養過夜，W含有空載體的細菌樣品和重組菌 做對照；
[0021] 2)次日，將實驗組與對照組按體積比1%接種量接種至新鮮50血發酵培養基中，37 °C，200r/min振蕩培養；
[0022] 3)待菌液生長至ODsqq到0.7左右時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L，30°C 誘導10小時。
[0023] 所述的發酵培養基包含如下組分：蛋白腺12g/L，酵母粉24g/L，K2HP〇472mmol/L， MgSOUOmmol/L，硫胺素0.034g/L，硫酸卡那霉素0.03g/L，微量元素2mL/L，該微量元素成分 為CaCl2 ·細2〇 0.74g/L，aiS〇4 · 7此0 0.18g/L，MnS〇4 · H20 20g/L，化2 ·抓TA 20.1g/L， 化5〇4〇.1邑/1，(：〇(：12〇.104邑/1，尸65〇4?7出0 2邑/1。
[0024] 進一步地，所述的步驟Ξ提取發酵上清液的方法為4°C下，轉速8000r/min，離屯、菌 液15min。
[0025] 本發明的另一目的是提供上述菊粉內切酶的制備方法的應用。
[00%] 本發明之所W對來源于Aspergillus ficuum ATCC 16882的編碼菊粉內切酶的 end〇-inu2基因進行密碼子優化是因為原核表達體系不能夠識別部分真核基因的密碼子從 而導致部分密碼子翻譯成錯誤氨基酸，為提高翻譯準確率對編碼基因進行密碼子優化w適 用于大腸表達體系。此外本發明對編碼菊粉內切酶基因的內源信號膚進行了切除是因為預 實驗結果表明來源于真核的內源信號膚序列在原核體系中不僅失去了其分泌功能而且降 低了目標蛋白的活性表達，使得翻譯表達出的菊粉內切酶蛋白多為包涵體影響酶活力。為 此本發明提供了一種在大腸桿菌表達體系中適配于菊粉內切酶的信號膚序列，其融合表達 效果不僅能夠提高目標蛋白的活性表達而且能實現大腸桿菌分泌表達，免除細胞破壁等后 期處理過程。
[0027] 而在大腸桿菌中選擇使用pET-28a( + )表達載體，運是因為pET系統是有史W來在 大腸桿菌化.coli)中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統。目的基因被克隆到祀T系統載 體上，受隧菌體T7強轉錄及翻譯信號控制；表達有宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7聚 合酶機制十分有效并具有選擇性;充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白； 誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可W占到細胞總蛋白的50% W上。此外祀T-28a( + ) 在C端設計了6個組氨酸的純化位點，組氨酸能夠提供配位電子與某些金屬離子(如Ni2+)馨 合，6個連續的組氨酸可W使蛋白有效吸附于含Ni 2+的層析填料上，因而可W利用金屬馨合 來純化融合蛋白，從而極大地簡化了重組蛋白的后續純化工作，非常適合大規模制備。
[0028] 本發明所述利用密碼子優化基因克隆表達制備出高效分泌的菊粉內切酶在水解 菊粉用于生產低聚果糖中的應用。
[0029] 將本發明所述的高效分泌菊粉內切酶的帶有密碼子優化基因重組大腸桿菌工程 菌Escherichia coli BL21祀T28a-pelB-NSinu2進行搖瓶發酵，僅需誘導8h發酵液上清中 即可達到最高酶活力75.22U/mg(蛋白），經儀柱純化后的酶液即可直接用于水解菊粉生產 低聚果糖，轉化效率高，此種菊粉內切酶的制備方法由于發酵時間短，酶活高，且無需破碎 細胞后期處理方便等優點在工業化大規模生產低聚果糖的應用中具有巨大的發展前景。
[0030] 本發明的有益效果是：所述含有優化后的基因序列pelB-NSinu2的工程菌株 Escherichi