一種水中腸道病毒分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水中病毒分離純化領域;具體設及一種水中病毒分離純化的方法。
【背景技術】
[0002] 病毒引發的腹瀉疾病在發展中國家有顯著的致死率，在發達國家也有很高的發病 率，其中兒童患者數量最高。引起急性腹瀉的常見病毒包括輪狀病毒(Rotaviruses)、諾如 病毒（NoroViruses)、星狀病毒(AstroViruses)、科薩奇病毒（CoxViruses)和腸道腺病毒 (Adenoviruses)等。由于我國腸道病毒檢測研究開展較晚，受限水中病毒分離純化方法，對 環境及生活水中腸道病毒的檢測至今沒有國家標準方法。在水中病毒分離純化技術方面， 現有技術普遍應用超速離屯、、電勢吸附洗脫結合有機絮凝等方對水樣本進行快速分離濃 縮，但是由于不同水質中病毒稀薄程度的差異，需要過濾大量水樣本，水中病毒分離純化效 率制約了后期的分子和細胞水平檢測方法，另一方面由于超速離屯、機等設備的過于昂貴， 使得普通檢測實驗室不具備實驗能力，制約了方法的應用。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決現有病毒濃縮方法中濃縮樣病毒回收率低和單位體積病毒含量低 的問題;而提供了 一種水中腸道病毒分離純化方法。
[0004] 本發明方法能夠高效提取水中腸道病毒，并應用巧光定量PCR及細胞水平檢測。 [000引本發明包括兩種方案:第一種方案是吸附洗脫超濾法，化noceram濾膜吸附多聚憐 酸鹽溶液洗脫結合Centrk:on 6Plus-70設備進行二次分離純化方法，該方法應用于大量水 樣;第二種方案是Centric0n?Plus-70設備一步分離純化方法，該方法應用于少量水樣。
[0006] 本發明的第一方案--水中腸道病毒分離純化方法是采用專利號 201410234128.4公開的裝置進行的，具體步驟如下：
[0007] 步驟一、將水樣裝入存儲罐中，閉合頂蓋；
[0008] 步驟二、然后通入氮氣調節存儲罐內的壓力，打開控制閥，使水樣通過過濾器流向 濾膜支架；
[0009] 步驟Ξ、待水樣全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜后停止進樣，關閉氮氣存儲罐， 使罐體泄壓；
[0010] 步驟四、更換新的存儲罐，向新的存儲罐中加入1L質量濃度為1%的多聚憐酸鋼溶 液，通入氮氣使存儲罐內的壓力上升至0.7個標準大氣壓；
[0011] 步驟五、打開控制閥，使多聚憐酸鋼溶液流向濾膜支架進行洗脫，通過放水管收集 洗脫液，待全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜后停止洗脫；
[001引步驟六、將濾液杯安裝于帶有樣品杯的CentficonKpius-70濾忍上，組裝成兩套離 屯、杯，然后用去離子水預潤洗；
[0013]步驟屯、取步驟五獲得的洗脫液120ml分成兩等份，然后分別裝入兩套離屯、杯的樣 品杯中后蓋蓋，再將兩套離屯、杯對稱放置在離屯、機內，離屯、10分鐘，取出兩套離屯、杯后將兩 個樣品杯分別由濾液杯上取下，棄去兩個濾液杯中過濾液；
[0014] 步驟八、重復步驟屯直至步驟五收集的洗脫液全部過濾完畢；
[0015] 步驟九、將經步驟八處理后的兩個帶有樣品的CentriconK Plus-70濾忍分別與收集 杯組裝成兩套收集裝置，然后對稱置于離屯、機中，離屯、2分鐘，然后合并兩個收集杯中樣本， 再用MEM培養基(minimum essential medium)稀釋至ImL，移至離屯、管內-70°C保藏備用。
[0016] 方案一進一步限定:步驟屯中在離屯、力為1900 Xg條件下離屯、。步驟九中在離屯、力 為800 X g條件下離屯、。步驟四所述多聚憐酸鋼溶液是由3.8111111〇1幾化2冊〇4、6.5mmol/L K出P〇4、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去離子水配制的。
[0017] 專利號201410234128.4公開的裝置包括氮氣壓力罐、存儲罐、過濾器和濾膜支架， 所述的存儲罐包括罐體和頂蓋，罐體設有寫頂，寫頂設有弧形縮口，頂蓋底端設有外翻沿， 密封圈置于外翻沿內，頂蓋由弧形縮口伸入并可通過密封圈卡在弧形縮口內，頂蓋頂端對 稱設有耳座，耳座內裝有杠桿，杠桿包括一個V'字形的提桿、兩個弧形的連接桿及兩個橫 折形的支撐桿，所述提桿兩端與連接桿通過過渡圓弧連接，連接桿的另一端與支撐桿圓弧 過渡連接，杠桿的支撐桿套在耳座內，支撐桿的底端可抵在寫頂上，過渡圓弧可抵在寫頂 上，寫頂上分別設有壓力表、進氣管和出水管，存儲罐的進氣管與氮氣壓力罐連接，出水管 底端穿過寫頂伸入到罐體底部，出水管頂端設有控制閥，控制閥與過濾器通過兩端連接快 速接頭的導管連接，過濾器與濾膜支架通過兩端連接快速接頭的導管連接，濾膜支架設有 放水管;所述濾膜支架內設有正電荷濾膜。
[0018] 本發明的第二方案一一水中腸道病毒分離純化方法是由下述步驟完成的：
[0019] 步驟1、將濾液杯安裝于帶有樣品杯的說恤ic〇n?Plus-70濾忍上，組裝成兩套離屯、 杯，然后用去離子水預潤洗；
[0020] 步驟2、向1L純水中投入腸道病毒樣本得到水樣，取水樣120mL分成兩等分，然后分 別裝入兩套離屯、杯的樣品杯中后蓋蓋，再將兩套離屯、杯對稱放置在離屯、機內，離屯、10分鐘， 取出兩套離屯、杯后將兩個樣品杯分別由濾液杯上取下，棄去兩個濾液杯中過濾液；
[0021 ]步驟3、重復步驟2直至樣本全部過濾完畢，收集樣本；
[0022] 步驟4、將經步驟3處理后的兩個帶有樣品的Ce恤-icon叩lus-70濾忍與收集杯組成 兩套收集裝置，然后對稱置于離屯、機中，離屯、2分鐘，然后合并兩個收集杯中樣本，再用MEM 培養基(minimum essential medi皿)稀釋至ImL，移至離屯、管內-70°C保藏備用。
[0023] 方案二進一步限定:步驟2中在離屯、力為1900 Xg條件下離屯、。步驟4中在離屯、力為 800 Xg條件下離屯、。步驟2中腸道病毒樣本按下述投入量投加：1L純水中諾如病毒的投入量 1.47E+03~1.47E+07; 1L純水中輪狀病毒1.06E+03~1.0犯+07; 1L純水中星狀病毒2.07E+ 02~2.07E+06; 1L純水中科薩奇病毒3.50E+01~3.50E+06; 1L純水中腸道腺病毒3.60E+02 ~3.60化07。
[0024] 本發明方法相對于現有方法做出了 W下改變，將洗脫液由有機溶劑牛肉浸出液換 成了無機溶劑多聚憐酸鹽溶液，一方面克服了 Centricon? Plus-70設備過濾堵塞的問題，同 時保證洗脫效率和病毒活性，減小了濃縮樣本終體積，提高了單位體積內病毒樣本含量。
【附圖說明】
[002引圖1是離屯、杯結構示意圖；圖2是收集裝置示意圖；圖中1一一蓋，2-一樣品杯， 3--CenUicon卽lus-70濾忍，4--濾液杯，5--收集杯。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0026] 一：本實施方式中水中腸道病毒分離純化方法是采用專利號 201410234128.4公開的裝置進行的，具體步驟如下：
[0027] 步驟一、將水樣裝入存儲罐中，閉合頂蓋；
[0028] 步驟二、然后通入氮氣調節存儲罐內的壓力，打開控制閥，使水樣通過過濾器流向 濾膜支架；
[0029] 步驟Ξ、待水樣全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜后停止進樣，關閉氮氣存儲罐， 使罐體泄壓；
[0030] 步驟四、更換新的存儲罐，向新的存儲罐中加入1L質量濃度為1%的多聚憐酸鋼溶 液，通入氮氣使存儲罐內的壓力上升至0.7個標準大氣壓，
[0031 ]其中，所述多聚憐酸鋼溶液是由3.8mmol/LNa2HP〇4、6.5mmol/L K出P〇4、0.05mol/L 氨基乙酸(glycine)和去離子水配制的；
[0032] 步驟五、打開控制閥，使多聚憐酸鋼溶液流向濾膜支架進行洗脫，通過放水管收集 洗脫液，待全部通過濾膜支架內的正電荷濾膜后停止洗脫；
[0033] 步驟六、將濾液杯4安裝于帶有樣品杯2胞C謝扣城n?Plus-70濾忍3上，組裝成兩套 離屯、杯(參見圖1)，然后用去離子水預潤洗；
[0034] 步驟屯、取步驟五獲得的洗脫液120ml分成兩等份，然后分別裝入兩套離屯、杯的樣 品杯2中后蓋蓋1，再將兩套離屯、杯對稱放置在離屯、機內，在離屯、力為1900 Xg條件下離屯、10 分鐘，取出兩套離屯、杯后將兩個樣品杯分別由濾液杯4上取下，棄去兩個濾液杯4中過濾液；
[0035] 步驟八、重復步驟屯直至步驟五收集的洗脫液全部過濾完畢；
[0036] 步驟九、將經步驟八處理后的兩個帶有樣品的Cemricon't Plus-70濾忍3分別與收 集杯5組裝成兩套收集裝置(參見圖2)，然后對稱置于離屯、機中，在離屯、力為800 Xg條件下 離屯、2分鐘，然后合并兩個收集杯中樣本，再用MEM培養基(minimum essential medium)稀 釋至ImL，移至離屯、管內-70°C保藏備用。
【具體實施方式】 [0037] 二：本實施方式中水中腸道病毒分離純化方法是由下述步驟完成 的：
[0038] 本發明的第一方案一一水中腸道病毒分離純化方法是由下述步驟完