一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，治療性抗體在臨床上的應用越來越廣泛。2000-2010年，抗體藥物在全球 生物制藥中所占份額從10.5 %擴張到56.41 %，預計2015年全球抗體藥物市場規模有望達 至化80億美元。抗體恒定區缺少核屯、巖藻糖基化的治療性抗體目前正處于臨床研究中，它們 在體外和體內都可W促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody dependent cellular c^otoxicity，ADCC)，運種生理活性引起人們廣泛關注，并成為此類藥物研究的 執占之一。 "、W、、、?^*^·^· 〇
[0003] 近年出現多種基因組編輯技術，主要有：鋒脂核酸酶技術（zinc finger nuclease ,ZF化）、轉錄激活樣效應核酸酶技術（transcription activator-Uke effector nucleases，TALEN)與RNA導向的CRISPR-Cas9核酸酶系統。CRISPR-Cas9核酸酶系統是近年 來發現并被廣泛應用于真核細胞基因組編輯的一種技術。該技術利用化s9切割祀序列形成 雙鏈斷裂(DSB)，隨后通過非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復化DR)進而達到對祀基因 序列編輯的目的。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一株重組細胞及其在制備抗人表皮生長因子受體治療藥物 中的應用。
[0005] 本發明首先保護一株重組細胞，即重組細胞CH0-Kl-EGFR-7gRNA。重組細胞CH0-Kl-EGFR-7gRNA是將CH0-K1-EGFR細胞的基因組中序列表的序列6所示的DNA分子取代為序 列表的序列7所示的DNA分子得到的重組細胞;所述CH0-K1-EGFR細胞的制備方法如下:將產 品甲和產品乙共同導入C冊-K1細胞，得到C冊-K1-EGFR細胞;所述產品甲為如下（a)或（b): DNA分子甲；（b)含有所述DNA分子甲的重組表達載體甲；所述DNA分子甲為編碼序列表的序 列1所示的輕鏈L4的DNA分子。所述DNA分子甲具體可為序列表的序列2所示的DNA分子或序 列表的序列2自5 '末端第9-729位核巧酸所示的DNA分子或序列表的序列2自5 '末端第85-726位核巧酸所示的DNA分子。所述重組表達載體甲具體可為在pcDNA-3.3載體的多克隆位 點（例如化ndm和Notl酶切位點之間）插入所述DNA分子甲得到的重組質粒。所述產品乙為 如下（C)或(d):DNA分子乙；（b)含有所述DNA分子乙的重組表達載體乙；所述DNA分子乙為編 碼序列表的序列3所示的重鏈H3的DNA分子。所述DNA分子乙具體可為序列表的序列4所示的 DNA分子。所述重組表達載體乙具體可為在pOptiVEC載體的多克隆位點（例如化nd虹和Notl 酶切位點之間）插入所述DM分子乙得到的重組質粒。
[0006] W上任一所述重組細胞C冊-Kl-EGFR-7gRNA分泌的抗體（IgG)也屬于本發明的保 護范圍。
[0007] 本發明還保護所述抗體在制備用于殺傷腫瘤細胞的藥物中的應用。所述腫瘤細胞 可為表皮癌細胞。所述腫瘤細胞具體可為A431細胞。
[0008] 本發明還保護一種用于殺傷腫瘤細胞的藥物，其活性成分為所述抗體。所述腫瘤 細胞可為表皮癌細胞。所述腫瘤細胞具體可為A431細胞。
[0009] 本發明還保護所述抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。所述癌癥可為表皮 癌。所述癌癥具體可為A431細胞引起的表皮癌。
[0010] 本發明還保護一種用于治療癌癥的藥物，其活性成分為所述抗體。所述癌癥可為 表皮癌。所述癌癥具體可為A431細胞引起的表皮癌。
[0011] 本發明對于癌癥的治療具有重大的應用價值。
【附圖說明】
[0012] 圖1為巧tgRNA在化巧中祀標位置。
[001引圖2為Western Blot的結果。
[0014] 圖3為錯配酶T7E1檢測切割效率的結果。
[0015] 圖4為細胞生長情況檢測的結果。
【具體實施方式】
[0016] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果取平 均值。
[0017] pSpCas9(BB)-2A-化ro載體：購自 addgene，目錄號PX459。C冊-K1 細胞:ATCC，(：化-61cCD C冊 Medium:G化CO產品，目錄號 10743-〇29D〇ptiMEM I Medium:G化CO產品，目錄號 31985-070。脂質體（Fugene皿）：購于Promega公司，目錄號E2311。嚷嶺霉素：購于Gene Operation公司，目錄號ISY1130-0025MG。西妥昔單抗(溶液形式：100mg/50ml，無色透明液 體，IgG抗體）：德國Merck公司，進口藥品證號：S20050095,產品批號7667201dA431細胞(人 表皮癌細胞）：ATCC，C化-1555epcDNA-3.3 載體：Invitrogen公司，目錄號 K8300-01。 pOptiVEC載體：Invitrogen公司，目錄號 12744-017。
[001引輕鏈L4的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2自5'末 端第85-726位核巧酸所示。
[0019] 重鏈H3由重鏈可變區（VH)、重鏈恒定區1 (CH1)、較鏈區、重鏈恒定區2 (CH2)和重鏈 恒定區3(CH3)組成化3 = VH+CHl+hinge+C肥+CH3)。重鏈H3的氨基酸序列如序列表的序列3 所示，其編碼基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1-145位氨基酸為重鏈可變 區（VH)，第146-243位氨基酸為重鏈恒定區1 (CH1)，第244-258位氨基酸為較鏈區化inge)， 第259-369位氨基酸為重鏈恒定區2(C肥），第370-475位氨基酸為重鏈恒定區3(C冊）。
[0020] 實施例1、CH0-K1-EGFR細胞的制備
[0021] CH0-K1-EGFR細胞即表達抗EGFR人源化抗體L4冊的CH0-K1細胞，其構建過程如下：
[0022] 1、將序列表的序列2自5'末端第9-729位核巧酸所示的雙鏈DNA分子插入pcDNA-3.3載體的Hind虹和Notl酶切位點之間，得到重組質粒pcDNA-3.3-L4。
[0023] 2、將序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子插入pOptiVEC載體的化nd虹和Notl酶切 位點之間，得到重組質粒pOp t i VEC-冊。
[0024] 3、將重組質粒PCDNA-3.3-L4和重組質粒p0ptiVEC-H3通過共轉染的方式共同導入 C冊-K1細胞，得到重組細胞，將其命名為C冊-K1-EGFR細胞。
[00巧]實施例2、重組細胞的發現
[0026] 一、RNA 的設計
[0027] C冊-K1-EGFR細胞中化t8基因的開放閱讀框如序列表的序列5所示，包含9個外顯 子，其中第1-203位核巧酸為外顯子1序列，第204-319位核巧酸為外顯子2序列，第320-482 位核巧酸為外顯子3序列，第483-597位核巧酸為外顯子4序列，第598-835位核巧酸為外顯 子5序列，第836-1082位核巧酸為外顯子6序列，第1083-1259位核巧酸為外顯子7序列，第 1260-1410位核巧酸為外顯子8序列，第1411-1728位核巧酸為外顯子9序列。
[002引通過預實驗，發明人設計了巧中gRNA如下（7種gRNA在化t8中祀標位置如圖1所示）： 1gRNAl、1gRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、7gRNA和8gRNA。1gRNAl、lgRNA2、2gRNA、5gRNA、6gRNA、 7gRNA和8gRNA分別作用于化t8基因的第1個外顯子、第1個外顯子、第2個外顯子、第5個外顯 子、第6個外顯子、第7個外顯子與第8個外顯子。1排NA1祀向序列表的序列5中第66-85位核 巧酸，lgRNA2祀向序列表的序列5中第182-201位核巧酸，2gRNA祀向序列表的序列5中第 278-297位核巧酸，5gRNA祀向序列表的序列5中第736-755位核巧酸，6gRNA祀向序列表的序 列5中第1005-1024位核巧酸，7gRNA祀向序列表的序列5中第1090-1109位核巧酸，8gRNA祀 向序列表的序列5中第1335-1354位核巧酸。巧中gRNA的祀標序列如表1所示。
[0029] 表1 7種gRNA的祀標序列
[0030]
[0032] 二、構建重組質粒
[0033] 分別合成單鏈DNA分子Oligo巧日單鏈DNA分子Oligo II，然后將上述兩條單鏈DNA 分子進行退火，形成兩端均具有粘末端的雙鏈DNA分子，將雙鏈DNA分子插入pSpCas9(BB)-2A-Pu;ro載體的抓si酶切位點得到重組質粒。
[0034] 表達IgRNAl的重組質粒命名為重組質粒pSpCas9(BB)-2A-Pur〇-