一種人臍血來源的調節性巨噬細胞及其分離純化和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及調節性巨噬細胞的來源、分離純化及培養的技術領域。具體涉及一種利用人臍帶血誘導培養得到的具有免疫抑制能力的調節性巨噬細胞，及其分離純化和培養方法。
【背景技術】
[0002]盡管現在已有廣譜的免疫抑制劑用于阻止急性移植后器官排斥的發生，但是終生使用免疫抑制藥物，將引起的眾多不良副反應，如腎毒性，代謝紊亂，心血管疾病以及導致感染或者腫瘤發生風險增加。因此尋找合適的長效免疫抑制方法仍然是現在的研究熱點。調節性巨噬細胞是近年來研究發現的一組高度分化具有高效抑制T細胞應答潛能的巨噬細胞亞群，它能夠用于預防和治療免疫排斥，目前已經在臨床實驗上開展，在器官移植后誘導移植物免疫耐受。調節性巨噬細胞是從外周血中CD14+單核細胞誘導而來，在特殊培養基中培養6天后加入γ干擾素刺激24小時，分化后的調節性巨噬細胞具有均一性表型為CD14-/low HLADR+CD80-/low CD86+⑶16-，能夠通過直接接觸吞噬T細胞，或者增強吲哚胺2，3雙加氧酶(ID0)表達剝奪色氨酸，間接抑制T細胞的增值(Hutchinson JA, Riquelme P ,Sawitzki B,et al.Cutting edge:1mmunologicalconsequences and trafficking ofhuman regulatory macrophages administeredto renal transplant recipients.JImmunol 2011; 187:2072-2078)。在歐洲多中心合作的One Study臨床研究中，已經開始在腎移植后使用供體來源的調節性巨噬細胞，經過一年多的追蹤隨訪，認為其在腎移植上的使用是安全及有效的(James A.Hutchinson,Paloma Rique Ime , and EdwardK.GeissIer.Human regulatory macrophages as a cell—based medicinalproduct.Curr Opin Organ Transplant2012; 17:48-54)。因此在臨床應用中，使用調節性巨噬細胞將成為一種很有潛力的預防移植后免疫排斥的干預措施。
[0003]但是供體來源的調節性巨噬細胞必須在供體經過外周血動員后培養7天才能得到足夠移植的量，而如果使用DCD供體來源的器官，則較難得到這種免疫調節細胞，這使其在移植免疫上的應用大大受到限制。臍血內含有豐富的造血干/祖細胞，自上世紀90年代以來，臍血干細胞移植技術在全世界得到快速發展，世界各國臍血庫應運而生，將原本自然流失的臍帶血，經分離檢測深低溫保存，以備臨床應用。現在已有多種細胞可以從臍血中獲得，如間充質干細胞，調節性T細胞等。從臍血中獲得的細胞因其來源廣泛、無創傷性、并且免疫原性低，十分適合在臨床使用。如人臍血來源的調節性T細胞就比從外周血來源調節性T細胞的在第三方移植受體中存活時間更長，發揮的功能更加強大。因此，如果我們能夠從臍血中分離并誘導得到調節性巨噬細胞，并確定純度和功能，將大大有助于其在臨床上的使用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的旨在提供一種具有良好的免疫抑制能力的人臍血來源的調節性巨噬細胞，并建立一種穩定的從人臍血中分離獲取以及培養該種調節性巨噬細胞的方法。本發明確立了人臍血來源的調節性巨噬細胞在產量、純度、功能等方面相對于常規來源于成體外周血的調節性巨噬細胞存在一定優勢。
[0005]—種人臍血來源的調節性巨噬細胞。
[0006]所述的人臍血來源的調節性巨噬細胞的分離純化方法，用密度梯度離心法分離得到臍血單個核細胞，通過⑶14+免疫磁珠陽性分離獲得富含調節性巨噬細胞的⑶14+胞群。
[0007]具體包括以下步驟:
[0008]I)臍血單核細胞分離:以1ml人淋巴細胞分離液置于50ml離心管下層，然后收集抗凝臍帶血用PBSl:1稀釋后得到的40ml血細胞懸液輕柔加在上層，兩層之間有明顯界限，20°C，1800-2000rpm離心30分鐘，吸取中間云霧層獲得單個核細胞，PBS洗滌2次后計數；
[0009]2)CD14+陽選:
[0010](I)收集步驟I)得到的細胞，然后用分選緩沖液Sorting buff er以1.25 X 15個cells/ul重懸，每16個細胞加入2μ1的CD14 MicroBeads微磁珠，4°C孵育10-15分鐘；
[0011 ] (2)以每16個細胞加入0.2-0.3mlSorting Buffer終止微磁珠與細胞的結合，1200rpm離心10分鐘，每18個細胞用500μ1的Sorting Buffer重懸待用；
[0012](3)選擇LS分離柱，將分離柱安裝入磁場中，每次加入Iml Sorting Buffer緩沖液洗柱，洗3次，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱；
[0013](4)將細胞懸液加入分離柱中，在重力作用下自然流盡，收集流出分離柱的液體，此時流出來的細胞為CD14-細胞；
[0014](5)將LS分離柱移出磁場，在分離柱下接無菌離心管，往分離柱中加入5mlSorting Buffer緩沖液，用活塞將附在分離柱上的細胞壓入離心管中，繼續往分離柱中加入5ml Sorting Buffer緩沖液重復該步驟一遍，計數細胞后1200rpm離心10分鐘，得到的細胞為⑶14+細胞；
[0015](6)將步驟(5)得到的細胞以每18個細胞用500μ1的Sorting Buffer重懸；重復操作步驟(3)—(5)—次；
[0016](7)分離⑶14+細胞用PBS洗滌2次后待培養。
[0017]所述的人臍血來源的調節性巨噬細胞的培養方法，包括以下步驟:
[0018]I)用新鮮配制的調節性巨噬細胞培養基重懸細胞濃度為16個cellS/3-5ml，放入促進細胞貼壁的培養皿中37°C，5 % CO2培養，隔天換液;所述的調節性巨噬細胞培養基是在RPM1-1640培養中添加10-12%的人AB血清、5-10ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子M-CSF、1%青霉素和鏈霉素雙抗；
[0019]2)培養至第6天時加入終濃度為25-50ng/ml的干擾素IFN-γ刺激18-24小時；
[0020]3)培養至第7天，獲得調節性巨噬細胞。
[0021]本發明的優點在于:確定了臍血來源的調節性巨噬細胞的分離誘導純化以及培養方法，通過將成體外周血來源的調節性巨噬細胞與其在形態、產量、表型、功能等方面作對比。發現臍血來源的調節性巨噬細胞表型與成體外周血來源的調節性巨噬細胞類似，功能優于外周血來源的調節性巨噬細胞，因此可以建立在臨床上供第三方使用的調節性巨噬細胞庫。
【附圖說明】
[0022]圖1為兩種不同來源調節性巨噬細胞顯微鏡下形態，放大倍數；
[0023]外周血來源(左)及本發明的調節性巨噬細胞(右)細胞形態放大倍數(100X);
[0024]圖2為外周血來源及本發明臍血來源的調節性巨噬細胞在單個核細胞中分選誘導后的得率；
[0025]圖3為流式細胞術檢測成體外周血來源及本發明臍血來源的調節性巨噬細胞表型；
[0026]圖4臍血來源調節性巨噬細胞抑制效應細胞的效果；
[0027]圖5外周血來源及本發明臍血來源的調節性巨噬細胞對淋巴細胞抑制效果的比較分析。
【具體實施方式】
[0028]為了更清楚地說明本發明，列舉以下實施例，但其對本發明的范圍無任何限制。
[0029]在以下實施例中，獲取30例正常分娩足月胎兒的臍靜脈血，結扎剪斷臍帶后立即進行臍靜脈穿刺采血，肝素抗凝。該實驗得到了中南大學湘雅三醫院倫理委員會的批準。進行實驗時，所采用的操作方法和操作步驟等，都是依據本技術領域的普通技術人員熟知的方法設計和實施。
[°03°] 如無特殊說明，細胞培養用的培養基和營養因子均購自Life technology和Sigma等全球各大生物試劑公司。所述焚光標記的鼠抗人抗體購自美國613；[08(^61186或130公司；Ficoll-Plus人淋巴細胞分離液購自GE生物公司，FC500流式細胞儀為美國貝克曼-庫爾特公司，分選CD 14+細胞的磁珠選用MACS Milteny B1tec公司的CDl4+Microbeads(human)磁珠分離試劑盒。
[0031 ]材料:磷酸緩沖液PBS、人血白蛋白、Cro-A(含腺嘌呤的檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液，購于Sigma公司)、CD14 MicroBeads微磁珠(取自MACS Milteny B1tec公司的CD14+Microbeads(human)磁珠分離試劑盒)、TrypLE Express?酶、BSA(牛血清白蛋白)、NaN3、FcR-block(Fc受體封閉劑)、IFN- γ ( γ干擾素)、RPMI_1640培養基、人AB血清、M-CSF巨細胞集落刺激因子、青霉素和鏈霉素(雙抗)、Ficoll-PluS人淋巴細胞分離液；
[0032]Sorting buffer分選緩沖液(PBS中含有10_12%CPD_A和0.5%人血白蛋白)
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