一種針對腫瘤干細胞的嵌合抗原受體t細胞的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種針對腫瘤干細胞的嵌合抗原受體。
【背景技術】
[0002]嵌合抗原受體T細胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR_T)是一種新發展起來的治療腫瘤的細胞治療技術。這種治療方式特異性高、效果好，受到了醫學界的重視。CAR-T的構成原理是，將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部scFv( single-chainvariable fragments，scFv))，與免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activat1n motifs，ITAM，通常為⑶3_ζ和FceRI γ )的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體(CAR)。患者的T細胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細胞。
[0003]目前CAR-T淋巴細胞技術已經發展到了第三代，第一代CAR由識別腫瘤表面抗原的單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv)和免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activat1n motifs，ITAM，通常為CD3_G和FceRI γ )組成。早期的實驗證明了 CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暫的T細胞增值和較低的細胞因子分泌，不能提供長時間的T細胞擴增信號和持續的體內抗腫瘤效應。依照T細胞活化的雙信號學說，T細胞的激活和增殖需要共刺激信號。
[0004]第二代CAR的胞內信號轉導區引入了共刺激因子，主要為CD28分子，增強了T細胞的增殖能力及細胞因子的分泌功能，IL-2、INF-γ以及GM-CSF增加，從而突破了腫瘤微環境的免疫抑制，延長了 AICD，第三代CAR在第二代的基礎上，增加了另外一種共刺激因子的胞內結構域，主要為⑶134(0Χ-40)或⑶137(4-1ΒΒ)等，旨在提高T細胞的細胞毒活性、增殖性與存活時間，促進細胞因子的釋放。
[0005]現有CAR-T存在的優點如下:
1、精準:嵌合的抗體中的抗原結合部可高效識別腫瘤抗原，精準殺滅；
2、高效:CAR-T細胞可不通過抗原呈遞細胞途徑既能實現高效識別腫瘤細胞；
多樣:CAR既可以利用腫瘤蛋白質抗原，又可利用糖脂類非蛋白質抗原，擴大了腫瘤抗原靶點范圍。
[0006]然而現有CAR-T技術同樣存在較大的缺點:
1、缺乏特異性抗原:由于一個CAR結構只識別一種抗原，而目前腫瘤特異性抗原很少，所以限制了 CAR-T的應用；
2、存在誤殺:由于缺少腫瘤特異性抗原，所以，一旦使用非特異性抗原制備抗體，CAR-T輸入人體后存在誤殺的可能性，從而存在引起免疫損傷。
[0007]上述缺點導致CAR-T的臨床應用存在較大的安全隱患，其應用也受到了限制。
【發明內容】
[0008]本發明的目的就在于為解決現有技術的不足而提供一種針對腫瘤干細胞的嵌合抗原受體T細胞，可實現特異性的殺傷的腫瘤干細胞。
[0009]本發明的目的是以下述技術方案實現的:
一種針對腫瘤干細胞的嵌合抗原受體T細胞，此種T細胞嵌合了2?3個獨立的抗原受體，每個嵌合的抗原受體分別由不同的腫瘤干細胞特異性標記物的抗體的抗原結合部與不同的功能蛋白結合組成，功能蛋白選自胞內免疫受體酪氨酸活化基序、共刺激因子I胞內結構域、共刺激因子2胞內結構域的一種或兩種組合;細胞外抗體部分與細胞內功能蛋白通過CD3_zeta跨膜區結構連接。
[0010]所述免疫受體酪氨酸活化基序為⑶3-ζ或FceRI γ。
[0011]所述胞內共刺激因子I為⑶28分子或⑶137分子或⑶134分子中的一個。
[0012]所述胞內共刺激因子2為與共刺激分子I不同的⑶28分子或⑶137分子或⑶134分子中的一個。
[0013]所述腫瘤干細胞為胰腺癌干細胞，特異性標記物為⑶24+、⑶44+和⑶133+。
[0014]此種T細胞嵌合了3個獨立的抗原受體，抗原受體I由CD24抗體的ScFv和胞內免疫受體酪氨酸活化基序組成;抗原受體2由CD44抗體的ScFv和胞內共刺激因子I胞內結構域組成;抗原受體3由CDl 33抗體的ScFv和胞內共刺激因子2胞內結構域組成;細胞外抗體部分與細胞內功能蛋白通過CD3_zeta跨膜區結構連接。
[0015]所述腫瘤干細胞為肝癌干細胞，特異性標記物為⑶90+和⑶44+。
[0016]此種T細胞嵌合了2個獨立的抗原受體，抗原受體I由CD90抗體的ScFv和胞內免疫受體酪氨酸活化基序組成;抗原受體2由CD44抗體的ScFv、胞內共刺激因子1、胞內共刺激因子2胞內結構域組成;細胞外抗體部分與細胞內功能蛋白通過CD3_zeta跨膜區結構連接。
[0017]此種T細胞嵌合了2個獨立的抗原受體，抗原受體I由CD90抗體的ScFv和胞內免疫受體酪氨酸活化基序和胞內共刺激因子I組成;抗原受體2由CD44抗體的ScFv和胞內共刺激因子2胞內結構域組成;細胞外抗體部分與細胞內功能蛋白通過CD3_zeta跨膜區結構連接。
[0018]本發明通過選擇不同的腫瘤干細胞特異性標記物(抗原)的抗體的抗原結合部與不同的功能蛋白組合，構建獨立的2-3個嵌合抗原受體，只有2-3個嵌合抗原受體均識別抗原后，才激活T細胞，從而實現對腫瘤干細胞的特異性殺傷，提高其安全性。
[0019]腫瘤干細胞具有極強的致瘤性，通過自我更新和無限增值維持著腫瘤細胞群的生命力；腫瘤干細胞的運動和迀徙能力又使腫瘤細胞的轉移成為可能；腫瘤干細胞可以長時間處于休眠狀態并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后一段時間復發。目前，在血液腫瘤、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌中均發現了腫瘤干細胞的存在。本發明構建的CAR-T可以特異性消滅腫瘤干細胞，消除腫瘤發展、侵襲、轉移、耐藥、復發的決定性因素，可對臨床治療起到積極的促進作用。
[0020]此外，此發明構建的針對腫瘤干細胞的CAR-T也可以作為腫瘤研究的有力工具，為腫瘤研究提供了新的方法:(I)用此工具消除腫瘤細胞中的干細胞后對細胞群落進行研究，以發現干細胞的有無對腫瘤細胞群落生存、發展的影響；(2)目前對一些腫瘤干細胞表面標記物的認定還未達成統一認識，可應用本發明的方法分別消除具有不同標記組合的腫瘤干細胞備選細胞后進行成瘤性等相關研究，以確認腫瘤干細胞的表面標記物。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是現有技術中CAR-T構建模型。
【具體實施方式】
[0022]—種針對腫瘤干細胞的嵌合抗原受體T細胞，此種T細胞嵌合了 2?3個獨立的抗原受體，每個嵌合的抗原受體分別由不同的腫瘤干細胞特異性標記物的抗體的抗原結合部與不同的功能蛋白結合組成，功能蛋白選自胞內免疫受體酪氨酸活化基序、共刺激因子I胞內結構域、共刺激因子2胞內結構域的一種或兩種組合;2個或3個抗原受體所結合的所有的功能蛋白要包括胞內免疫受體酪氨酸活化基序、共刺激因子1、共刺激因子2;細胞外抗體部分與細胞內功能蛋白通過CD3_zeta跨膜區結構連接。
[0023]所述免疫受體酪氨酸活化基序為⑶3-ζ或FceRIγ ;所述胞內共刺激因子I為⑶28分子;胞內共刺激因子I為CD28分子或CD137分子或CD134中的一個;胞內共刺激因子2為與共刺激分子I不同的⑶28分子或⑶137分子或⑶134中的一個。
[0024]—般腫瘤干細胞有2-3個標記物，采用上述方法構建CAR-T即可，但是也存在著少數多于3個標記物的腫瘤干細胞存在，可以按照上述方法制作2-3批針對不同標記物組合的新型CAR-T—起低劑量應用，如大腸癌干細胞的標記物是⑶133+24+44+以及⑶166+EpCAM+，可以制作2批分別針對⑶133+24+44+的，以及針對CD166+EpCAM+的CAR-T—起低劑量應用，CD133+24+44+CD166+EpCAM+干細胞即大腸癌干細胞上會結合2種CAR-T，即結合的CAR-T最多，因此干細胞被殺死的最多，對其他細胞可能也存在誤殺，但是誤殺幾率較小，因為相對于單一標記物來說，這些標記物組合是腫瘤細胞才有的，二是每種CAR-T低劑量使用，即使有誤殺，造成的影響也不大。
[0025]下面以胰腺癌干細胞和肝癌干細胞的嵌合抗原受體為例。
[0026]實施例1
胰腺癌干細胞的特異性標記抗原為CD24+、CD44+和CD133+，針對胰腺癌干細胞的嵌合抗原受體T細胞嵌合了 3個獨立的抗原受體，3個抗原受體分別由不同標記抗原的scFv與不同的功能蛋白組成;抗原受體I由CD24抗體的ScFv和胞內免疫受體酪氨酸活化基序組成，當然也可以由⑶24抗體的ScFv和選自⑶28分子或⑶137分子或⑶134任意一種共刺激因子胞內結構域組成;然后抗原受體2、抗原受體3分別與另外一種共刺激因子或胞內免疫受體酪氨酸活化基序組成。
[0027]作為其中一種優選的方案為:抗原受體I由CD24抗體的ScFv和胞內免疫受體酪氨酸活化基序CD3-e組成;抗原受體2由CD44抗體的ScFv和胞內共刺激因子I胞內結構域組成；抗原受體3由CDl 33抗體的ScFv和胞內共刺激因子2胞內結構域組成。
[0028]其構建方法采用融合蛋白技術，具體步驟示例如下:
1、⑶24的嵌合抗原受體標記:應用基因技術，將⑶24抗體的scFv蛋白的編碼基因與胞內免疫受體酪氨酸活化基序蛋白編碼融合表達；
2、CD44的嵌合抗原受體標記:應用基因技術，將CD44抗體的scFv蛋白編碼與CD28分子蛋白編碼融合表達；
3、CD133的嵌合抗原受體標記:應用基因技術，將CD133抗體的scFv蛋白編碼與CD134分子蛋白編碼融合表達；
4、轉染:應用轉染技術將這些融合蛋白的基因轉移進T細胞內，使得T細胞同時表達這3種融合蛋白。
[0029]上述技術具體步驟如下:
1)scFV基因片段的制備(以雜交瘤技術為例):分別從可合成目標抗原(CD133/24/44)抗體的雜交瘤細胞中提取總RNA并合成cDNA(例如Promega公司試劑盒)。以cDNA為模板，以輕鏈可變區VL及重鏈可變區VH的前后引物PCR擴增全套VL和VH基因。通過兩步法以VL和VH片段互為模板、引物，重疊PCR隨機拼接VL和VH為單鏈抗體(scFv)基因片段。scFv連接到NdeI和Xho I酶切的表達載體Pe t-28a (+)上，并轉入大腸桿菌No vagen公司。通過N1-NTA金屬親和層析法純化單鏈抗體。利用ELISA和western-blot鑒定大腸桿菌表達的單鏈抗體，以確定scFV的基因序列；