一種拉沙熱病毒核蛋白及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于病原檢測技術領域，具體設及一種拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法及 其在拉沙熱病毒核蛋白抗體檢測中的應用。結果顯示基因工程生產的拉沙熱病毒核蛋白NP 能與相應抗體特異性的結合，NP蛋白抗原用于NP抗體的檢測時具有很高的靈敏度和顯著的 特異性，具有開發成為檢測試劑盒的應用價值。
【背景技術】
[0002] 拉沙熱病毒化assa virus, LAV)能夠引起拉沙熱化assa fever)急性傳染疾病， 該疾病為人畜共患病，病程一般為1~4周，主要在尼日利亞、利比亞、塞拉里昂、幾內亞等 西非國家中流行，美洲、歐洲也曾發現輸入性病例，引起較高的發病率與死亡率。人感染拉 沙病毒后，大多數病人癥狀較輕，表現為發熱、嘔吐、腹瀉、咽炎等癥狀，嚴重者出現多臟器 功能障礙、衰竭，從而導致死亡，傳播能力極強。近年來，隨著中國和非洲經濟文化聯系的日 益密切，大量人員頻繁來往于中非之間，拉沙熱疫情將對中國的公共衛生體系建設和拉沙 熱疫情的防控帶來嚴峻的挑戰和威脅。為此，國家有關部口對此次疫情給W了高度關注，發 布了拉沙熱防控的指導性文件，啟動了相應的應急科技支撐項目。雖然拉沙熱病毒沒有在 世界范圍內造成大規模流行，但是，隨著經濟全球化進程的深入，非洲貿易、旅游、合作、及 人員往來的增多，拉沙熱病毒對各國人民的威脅與日俱增，像中國運樣一個人口眾多，人流 量大的國家，迫切需要對此類病毒的入侵做好儲備性工作，尤其是2014年西非的埃博拉出 血熱疫情的爆發，更需要特異性的檢測方法能對埃博拉出血熱等病毒感染和拉薩出血熱感 染進行鑒別。拉沙熱病毒感染的早期核酸和抗體檢測技術的建立和完善是有效進行拉沙熱 病毒防控的重要措施。
[0003] 血清學檢測方法之中，敏感性和特異性最高的檢測方法是ELISA法，可用于檢測 拉沙熱病毒抗原、特異性IgMJgG抗體，目前尚無商品化檢測試劑盒。原核表達系統pMal-c2x是基因工程技術中重要的的表達載體，其序列中具有誘導調控原件，可W人為控制蛋白 的表達。通常MBP標簽能夠增大在原核表達系統中表達的融合蛋白的可溶性，提高其表達 量。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是在于提供了一種含有拉沙熱病毒核蛋白NP蛋白基因的融合質粒， 該質粒表達能在細胞中能大量表達產生可溶性拉沙熱病毒核蛋白NP，適合作為檢測用抗 原，檢測方法靈敏度強，特異性好。
[000引本發明的另一個目的是在于提供了一種拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法，該方法 簡單易行，操作方便，易于生產，制備的蛋白純度高，產量大，可溶性強，易純化，可快速獲得 較多且純度較高的重組蛋白。
[0006]本發明的再一個目的是在于提供了一種重組基因工程抗原拉沙熱病毒核蛋白NP 在化ISA檢測人群血清藥物中的應用，該應用方法效果佳，檢測靈敏度強，特異性好，操作簡 單，設備要求低、檢測周期短，有很廣的應用面。
[0007] 為了實現上述的目的，本發明采用W下技術措施： 其技術構思是：申請人將原核表達系統PMAL-C2X，通過基因工程手段，與拉沙熱病毒核 蛋白NP進行重組，獲得融合質粒（圖1)。原核表達系統生產融合抗原，方法簡單，不易污染。 成功構建的pMAkC2X-LAV-NP表達載體，可W用于制備高產量、高純度的檢測用抗原拉沙熱 病毒核蛋白NP，且制備過程簡單方便，檢測活性高。
[0008] -種基因工程抗原拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法，其步驟是： A、 引物設計:設計兩條引物擴增拉沙熱病毒核蛋白NP基因，正向引物為5'- GAA TTC ATG AGT GCC TCA AAG GAA AT -3'（F),反向引物為5'- GTC GAC TTA CAG AAC GAC TCT AGG TGT C -3'（R); B、 PCR擴增基因：用擴增引物F(正向引物)和R擴增基因（反向引物），擴增模板為合成基 因，序列已公開化eneBank accession number NC_004296)ePCR反應的試劑如下：將扣1的 lOxTaq聚合酶緩沖液、1μ1的dNTP混合物、1μ1的引物F、化1的引物R、化1的擴增模板、1μ1的 TaqDNA聚合酶和40μ1的121°C、20min滅菌后的Mi 1 iQ超純水混合，PCR反應條件:94°C預變性 300秒、94°C變性30秒、53°C復性45秒、72°C延伸90秒、72°C最后延伸300秒，循環30次，獲得 擴增帶（圖2)。
[0009] C、融合載體構建：0.8%(m/v)瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，膠回收，與pGEM-T Easy載體（由PR0MEGA公司原產，CAT NO: A137A，請見遺傳資源表)連接，測序驗證序列。用 EcoR巧日Sail雙酶切含NP基因的DNA片段，與同樣雙酶切的pMAkC2X(由肥B公司原產），4 °C 下連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌3〇3日《曰(063)由齡￥曰旨日11公司原產，〔4了^):71400)。培 養菌株過夜，提取質粒，雙酶切驗證表明融合載體pMAkC2X-LAV-NP構建成功。
[0010] D、將步驟C獲得的融合載體進行培養，挑取轉化有表達載體的克隆株pMAレC2X-LAV-NP-Rosetta(DE3)至5 ml加入新鮮LB(加入50 mg/ml氨節青霉素和35 mg/ml氯霉素抑 制雜菌生長），過夜培養。
[0011] E、100 μ1培養物加至5 ml新鮮LB(加入50 mg/ml氨節青霉素和35 mg/ml氯霉素 抑制雜菌生長），37°C培養3 h，測00600=0.2~0.4。
[001引 F、加入誘導劑IPTG誘導蛋白表達，誘導條件為：IPTG濃度0.03mM、誘導溫度30°C、 誘導時間地。誘導完畢，吸取1ml菌液，8,000巧m離屯、10 min,分離得到菌體。
[0013] 6、倒盡培養基殘液，11111?85重懸菌體，超聲波破碎細胞，00600<0.1。12,000巧111 離屯、10 min,分離溶液相與固相，SDS-PAGE驗證目的蛋白有表達（圖3)。使用直鏈淀粉樹脂 純化收集溶液相中的帶有MBP-化g的目的抗原LAV-NP(圖4)，獲得基因工程抗原拉沙熱病毒 核蛋白NP。
[0014] 將獲得的克隆株Escherichia coli Rosetta (DE3)/pMAkC2X-LAV-NP在武漢大 學保藏，該菌株大腸桿菌Rosetta (DE3)/pMAkC2X-LAV-NP Escherichia coli Rosetta (DE3)/pMAl^-C2X-LAV-NP已于2015年12月2日保藏于中國典型培養物保藏中屯、（簡稱 CCTCC，湖北省武漢市武昌塔挪山），保藏編號為CCTCC Μ 2015719。
[0015] 含有拉沙熱病毒核蛋白NP蛋白基因的融合質粒構建過程中所述的IPTG是β-半乳 糖巧酶的活性誘導物質。基于運個特性，當pUC系列的載體DNA(或其他帶有lacZ基因載體 DNA)WlacZ缺失細胞為宿主進行轉化時、或用M13隧菌體的載體DNA進行轉染時，如果在平 板培養基中加入X-Ga巧PIPTG，由于β-半乳糖巧酶的α-互補性，可W根據是否呈現白色菌落 而方便地挑選出基因重組體。此外，它還可W作為具有lac或tac等啟動子的表達載體的表 達誘導物使用。
[0016] 檢測用拉沙熱病毒核蛋白NP在使用western-blot、化ISA方法檢測拉沙熱病毒核 蛋白抗體W及該化ISA方法在人群血清樣本檢測中的用途，一種重組基因工程抗原拉沙熱 病毒核蛋白NP在化ISA檢測人群血清藥物中的應用，它包括下列步驟： A. western-blot檢測拉沙熱病毒核蛋白NP抗體。將樣品進行SDS-PAGE后，150 mA， 45min將樣品轉移到PDVF膜上。5%(m/v)脫脂奶粉，4 °C下封閉過夜。TBST(Tris-Buffered Saline with 0.05% Tween-20)洗涂5次，每次間隔5minD2000倍稀釋陽性抗體LAV-NP作為 一抗，室溫解育1.5 hour。同樣方法洗涂5次，解育2000倍稀釋的帶有AP標記一羊抗兔二抗 (由碧云天公司提供，CAT NO: A0258)，在室溫下解育1 hour。洗涂后，將膜加入到含有底物 BCIP(300X)10 μ1，底物NBT(150X)20山，底物工作液3 ml的染色槽中，顯色約5分鐘后用 無菌水終止反應。實驗結果顯示抗原在Western-blot試驗中表現了極強的靈敏性及特異性 (圖 5)。
[0017] B.化ISA檢現啦沙熱核蛋白NP抗體。抗原與包被液(0.05 mol/L化2C03-Na肥03緩 沖液抑9.6)充分混合，4攝氏度包被過夜，每孔加入抗原稀釋液100 μ1(包被抗原濃度：1.5 μg/ml)ePBST(含0.05% tween-20)洗涂5次，注滿后，靜置3min，拍干。5%(質量體積)脫脂奶 粉在37攝氏度下，封閉1 hour，注滿，PBST洗涂5次。兔源拉沙熱核蛋白NP抗體用PBST，加入 1% (m