一種新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其產生菌和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵產新型抗菌脂膚,設及一種新型抗菌脂膚[ACl] Plipastatin及其產生菌和應用。
【背景技術】
[0002] 食品發酵工業、農業生產W及醫藥工業長期面臨W下一些問題:食品的微生物污 染,植物病蟲害,日益嚴重的致病菌抗藥性。傳統的解決方法(化學防腐劑、化學農藥、抗生 素)雖然可W暫時緩解矛盾,然而隨著檢測技術的進步W及環保意識的提高,人們開始注意 到上述化學藥劑的潛在危害。開發高效、安全無毒、性能穩定、廣譜的天然防腐劑已經成為 當前食品、醫藥、植物抗病基因工程領域的研究和應用熱點,將具有更廣闊的發展空間。
[0003] 基于科技的進步,檢測手段的完善W及人類對生態環境意識的提高,低毒、高效、 選擇性強、殘留時間短、對環境污染小的微生物天然防腐劑和生防試劑的研究和開發日益 引起國內外專家學者的關注。微生物是地球上分布最為廣泛的一大類生物,它無處不在,是 一個豐富的資源寶庫。細菌又作為自然界中分布最廣泛的一類微生物,W其繁殖速度快、適 應能力強、易于人工培養等優勢,倍受微生物工作者越來越多的關注。從微生物中提取抗菌 物質成本低、周期短、操作簡單方便、容易實現工業化生產,而且微生物分泌的抗菌物質抑 菌譜較寬,熱穩定性較好,適用pH范圍廣,使用過程不易產生抗性菌和交叉括抗性,因此可 W發揮更大的工業應用價值。
[0004] Fengycin家族的脂膚類化合物是由含有十個氨基酸的膚鏈與β-徑基脂肪酸鏈(通 常C14-C18)交聯形成的內醋環狀結構,具有專一的抗真菌活性。研究證明化ngycin合成酶 由NRPSs Fenl-化n5五個模塊構成,分別由基因 fenA-E編碼。該復合酶由于分子量在十萬至 百萬道爾頓之間,因此分離純化有一定難度。此外,Steller純化和鑒定了Plipastatin合成 酶,其序列、結構和功能與fengycin合成酶十分相似。而且Plipas1:atin與fengycin合成酶 基因開放閱讀框序列高度同源,研究認為Plipas化tin與fengycin為同一脂膚類物質
[0005] Plipastatin模塊中都有A-,PCP-,and C-domains,modifying domains。通過運些 模塊和結構域的線性排列,合成出具有10個氨基酸和β-徑基脂肪酸鏈的環形抗菌脂膚。通 過之前Claudia Qiiocchini(2006)的報道,NRPS系統中當COM即Linker結構域供體和受體 不相容時,產物形成終止,通過COM結構域的交換實驗,證實了 COM結構域對NRPS中蛋白質與 蛋白質之間的控制作用,去除COM結構域的選擇障礙,可W合成不同的脂膚產品。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是針對上述技術問題提供利用溫敏型質粒PKS2同源重組構建產抗菌 脂膚[Δα ]pl ipastatin的枯草芽抱桿菌PB2-LC1。
[0007] 本發明另一個目的是提供新型抗菌脂膚[ACl]Plipastatin的發酵、分離純化、結 構鑒定W及生物活性檢測的方法。
[000引本發明的目的通過下列技術方案實現:
[0009] -株產抗菌脂膚[ACl]plipastatin的枯草芽抱桿菌PB2-LC1,該菌株通過w下步 驟構建得到:
[0010] α)PMD-19T-ΔCl重組質粒構建:W保藏編號為CGMCCN0.11723的枯草芽抱桿菌 PB2-L基因組DNA為模板,W沈QIDN0.2所示的5'ppsC-D-ΔCl(ClaI)-F和沈QIDN0.3所 示的3'ppsC-D-ACl-S0E-R為引物進行P1 ipas化tin C和D亞基基因的上游同源臂PCR擴增; W沈QIDN0.4所示的5'ppsC-D-ΔCl-S0E-F和沈QIDN0.5所示的3'ppsC-D-ΔCUKpnI)-R為引物進行下游同源臂PCR擴增;取等摩爾體積的上游和下游同源臂擴增產物作為模板進 行PCR擴增,所用的正向引物和反向引物分別為:SEQ ID N0.2所示的5/ppsC-D-ΔCl (ClaI)-F和沈QIDN0.5所示的3'ppsC-D-ΔCUKpnI)-R,獲得融合的PlipastatinC和D亞 基基因上游和下游同源臂片段;將上述獲得的融合的Plipas化tin C和D亞基基因上游和下 游同源臂片段與PMD-19T載體鏈接,連接產物轉化Escherichia coli D冊α,挑取單菌落,接 種于含終濃度為lOOmg/mL氨節霉素的LB液體培養基中,37°C培養過夜,菌液經PCR擴增,篩 選陽性克隆,進行重組質粒的雙酶切鑒定,W及測序,得到含有Plipas化tin C和D亞基基因 上游和下游同源臂的PMD-19T-AC1質粒;
[0011] (2)將溫敏型質粒地S2和PMD-19T-AC1質粒分別用Clal和ΚρηΙ雙酶切,連接地S2 酶切后的大片段和PMD-19T-AC1質粒酶切后的小片段,連接產物轉化Escherichia coli D冊α,得到陽性轉化子,成功構建融合質粒地S2-AC1;
[0012](3)將構建好的融合質粒地52-么(:1轉化保藏編號為〔610:^).11723的枯草芽抱 桿菌?82-1^菌株,^沈9 10側.6所示的5'?1(5-1058斗觀斗和569 10側.75'?1(5-1058斗觀-R為引物PCR擴增,驗證得到的陽性轉化子,通過同源重組的方法整合到B. subti 1 iS PB2-L 菌株的基因組上獲得產抗菌脂膚[ACl]plipastatin的枯草芽抱桿菌PB2-LC1。
[0013] 本發明所述的枯草芽抱桿菌PB2-LC1在產抗菌脂膚[ACl]plipastatin中的應用。
[0014] 利用枯草芽抱桿菌(B. subtilis)PB2-LCl菌株制備抗菌脂膚[ACl]plipastatin 的方法,包括下列步驟:
[0015] a.將枯草芽抱桿菌(B.subtilis)PB2-LCl進行培養,得到抗菌物質發酵液;
[0016] b.抗菌物質發酵液離屯、,收集上清液,酸沉,將沉淀進行甲醇抽提,得抗菌提取物;
[0017] C.抗菌提取物通過HPLC分離純化[ACl ]Plipastatin。
[0018] 進一步,所述的方法優選包括下列步驟:
[0019] a.枯草芽抱桿菌 PB2-LC1 產[ACl]Plipastatin 的發酵
[0020] 將枯草芽抱桿菌PB2-LC1接種于試管斜面營養瓊脂培養基上,37°C培養2地,將菌 種活化;再將試管斜面活化的枯草芽抱桿菌PB2-LC1菌種接種于LB液體培養基,37°C、 18化pm培養20~2地,至對數生長期,制成濃度為10 7~108c化/1的種子液;將枯草芽抱桿菌 PB2-LC1種子液W3-5%濃度接種于Landy發酵培養基中,在33°C和ISOrpm條件下培養72h, 得到抗菌物質發酵液;
[0021] b.枯草芽抱桿菌PB2-LC1產[Δα ]Plipastatin的分離
[0022] ①取上述發酵液在5000r/min下離屯、25min除去菌體,上清液調pH至2.0,低溫過 夜,500化/min離屯、20min取沉淀,用甲醇溶解,調節pH至7.0,于磁力攬拌器上低溫攬拌化, lOOOOr/min離屯、20min后得到的上清液即為[ACl]Plipastatin粗提物;
[0023] ②枯草芽抱桿菌PB2-LC1產抗菌物質高效液相色譜分析(HPLC):將[ACl] plipastatin提取物采用RP-C"柱(4.6mmΦX250mm)進行腫LC分離純化[ΔCl] p 1 i pas tat in;洗脫液為均含有1 %〇Ξ氣乙酸的水(A)和乙臘(B)溶液(Ξ氣乙酸和乙臘為 MERK公司產品),梯度洗脫條件為:0~10min,B 5%;10~60min,B 95%;流速為0.80ml/ min;檢測波長為214nm;[ACl]Plipastatin的HPLC洗脫保留時間分別約為31~35min;
[0024] C.枯草芽抱桿菌PB2-LC1產抗菌物質的鑒定
[0025] 枯草芽抱桿菌PB2-LC1抗菌提取物經HPLC分離后,各抗菌組分再利用電噴霧電離、 誘導石並撞角軍離質譜(Electrospray ioniz曰tion m曰ss spectrometry/collision-induced dissociation,ESI-MS/CID)測定其分子量和鑒定其結構。
[00%] 所述的方法,其中步驟b中高效液相色譜儀為美國AGILENT llOOseries,配備DVD 檢測器。
[0027]所述的方法,采用液相色譜-傅里葉變換離子回旋共振高分辨質譜儀化C-FTICR-MS)測定樣品的分子量進行分析,液相色譜條件中流動相成分和比例與HPLC中的相同,梯度 洗脫條件為:0-20min,B 5-95 % ; 20-22min,B 95-100 %,流速為0.2ml/min;電噴霧源操作 電壓為5kV,操作溫度為300°C,操作壓力為20abr。
[00%]本發明利用枯草芽抱桿菌PB2-LC1生產的抗菌物質[ACl]Plipastatin:來自枯草 芽抱桿菌(B.subtilis)PB2-LCl,是一系列線性抗菌脂膚類化合物的總稱,共有7種組分,經 過 LC-FTICR-MS 鑒定分子量,分別為:980、994、1008、1022、1036、1050和10640曰。
[0029] 本發明的有益效果:
[0030] [ACl]Plipastatin是一類新型Plipastatin類抗菌脂膚的總稱,對大腸桿菌、藤 黃微球菌、點青霉和桃軟腐病菌都有抑制作用,能夠防治多種植物病害。此種抗菌脂膚是通 過人工定向改造,產生的新型抗菌脂膚,在世界范圍內還沒有報道。
[0031] 本發明采用的B.subtilis是被美國環保署列為可商業上應用的微生物菌種之一, 我國農業部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種,并在農業領域已得到廣泛的應用。枯草 芽抱桿菌PB2-LC1抗菌脂膚[ACl]Plipastatin抗菌脂膚屬于人工改造微生物天然抗菌膚, 對人類健康和食品安全性高,不會導致對環境的污染,可用于生物防治、食品加工和農產品 膽藏保