一種萬古霉素培養基及制備萬古霉素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及藥物生產領域，特別設及一種萬古霉素培養基及制備萬古霉素的方 法。
【背景技術】
[0002] 近年來，由于青霉素的廣泛的運用造成了大量的青霉素抗性革蘭氏陽性感染，萬 古霉素就成為了對細菌作戰的最后的防線。隨著萬古霉素的需求的增加，如何改進現有的 萬古霉素生產工藝提升萬古霉素的產量便成為研究的熱點。
[0003] 在現有的萬古霉素的生產工藝中，普遍采用控制放線菌屬東方擬無枝酸菌在發酵 條件下產生萬古霉素，再經過分離純化后得到萬古霉素純品的方法。由此可見，萬古霉素的 發酵步驟在整個生產工藝中對產量能夠產生至關重要的影響。因此如何改進現有的發酵工 藝便成為如何提升萬古霉素產量的重點。
[0004] 而在現有的發酵工藝中，培養基對發酵過程起著關鍵的作用。在現有菌種的情況 下，萬古霉素的產量和質量的提高，只能通過工藝的優化從而改變產量及質量。而培養基的 優化也就成為重點的研究對象。
【發明內容】
[000引本發明的目的是提供一種萬古霉素培養基，該培養基能夠顯著提高萬古霉素在發 酵步驟的收率。本發明的另一個發明目的是提供一種制備萬古霉素的方法。該方法應用萬 古霉素培養基，從而提高萬古霉素的收率和純度。
[0006] 本發明的上述技術目的是通過W下技術方案得W實現的： 一種萬古霉素培養基，其特征是:包括如下重量份數的組分： 碳源 ].5-5份 氮源 Q.05-Q.巧份 無機鹽 0.15-0.45份 氷 90-Π 0份 所述無機鹽包括硫酸儀、硝酸鐵和氯化鋼，按照重量份，硫酸儀:硝酸鐵:氯化鋼=0.5-2:0.5-2:1。
[0007] 還包括重量份為0.04-0.06份的pH調節劑，所述pH調節劑包括憐酸二氨鋼和憐酸 氨二鋼，按照摩爾比，憐酸二氨鋼:憐酸氨二鋼=0.15-0.19:1。
[000引還包括甘氨酸、色氨酸、酪氨酸組成的重量份為0.05-0.1份的氨基酸復合物，按照 重量份，甘氨酸:色氨酸:酪氨酸=3-8:1:3-5。
[0009] 所述碳源選自可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖中的一種。
[0010] 所述氮源由尿素、棉巧餅粉和乙酸錠混合而成，按照重量份，尿素:棉巧餅粉:乙酸 錠=3_5:1:2_4。
[0011] -種應用萬古霉素培養基的萬古霉素制備方法，包括如下步驟:搖瓶種子接種、種 子罐萬古霉素培養基培養、發酵罐萬古霉素培養基培養、預發酵液預處理、陶瓷膜過濾、一 次納濾、草酸沉淀、一次板框過濾、一次過柱純化、二次納濾、一次結晶、二次板框過濾、活性 炭脫色、脫色板框過濾、二次過柱純化、超濾、Ξ次納濾、二次結晶、真空抽濾、晶體溶解、冷 凍干燥、打粉包裝，其中 ① 發酵液的預處理:按照發酵液體積的0.1-0.5 %往萬古霉素發酵液加入質量分數為 10-20%的鹽酸進行成鹽，攬拌30min得到預處理液； ② 草酸沉淀:將一次納濾得到的濃縮液加入草酸沉淀罐，再加入一次納濾得到的濃縮 液重量的0.001-0.004 %的固體草酸鋼，攬拌30-50min后靜置； ③ 活性炭脫色:將二次板框過濾得到的一次結晶體加入活性炭脫色罐，加入去離子水 溶解，攬拌并加熱，待一次結晶體的溶液沸騰時加入一次結晶體重量的3-6%的活性炭進行 脫色30min。
[0012] 所述板框過濾中，過濾介質為濾板，所述濾板上預涂有2mm的助濾劑，所述助濾劑 為活性炭。
[0013] 所述一次結晶和二次結晶過程中均加入晶體重量10倍的有機溶劑進行結晶，所述 有機溶劑選用乙醇、丙酬和乙酸中的其中一種，所述一次結晶和二次結晶的起始溫度為35-45°C，終點溫度為0-15°C，降溫速度為l-3°C/min。
[0014] 所述晶體溶解步驟為:將真空抽濾得到的二次結晶體加入溶解罐中，加入二次結 晶體重量8-12倍的去離子水，攬拌30min至二次結晶體完全溶解形成溶解液。
[0015] 所述一次過柱純化采用SP825樹脂，所述二次過柱純化采用HP20SS樹脂。
[0016] 綜上所述，本發明具有W下有益效果： (1) 在培養基中加入包括硫酸儀、硝酸鐵和氯化鋼的無機鹽，補充微量元素，起到提高 萬古霉素的產量作用； (2) 氨基酸復合物可作為氮源補充物;相比于尿素和棉巧餅粉等需要經過代謝后才能 得W吸收利用，甘氨酸、色氨酸、酪氨酸可直接被菌體吸收利用，提高吸收效率，提高萬古霉 素產量； (3) 加入抑調節劑，調節培養基的抑至7.2左右，提供菌體合適的酸堿度環境有利于菌 體的生長和生命活動。同時本發明人意外地發現同時加入包括憐酸二氨鋼和憐酸氨二鋼的 P的周節劑和包括硫酸儀、硝酸鐵和氯化鋼的無機鹽比單獨加入包括憐酸二氨鋼和憐酸氨二 鋼的pH調節劑或者包括硫酸儀、硝酸鐵和氯化鋼的無機鹽能夠提高萬古霉素的產量和純 度； (4) 選用尿素、棉巧餅粉和乙酸錠Ξ種含氮物質作為氮源，其中尿素和棉巧餅粉中的氮 W有機物形式存在，而乙酸錠作為有機鹽，乙酸錠中的氮比有機物中的氮更容易吸收，且本 發明人意外發現相比于其他錠鹽，乙酸錠能夠顯著提高萬古霉素的產率和純度;而乙酸錠 中的NH4+和無機鹽中氯化鋼中的Cr結合形成氯化錠，在氯化錠被菌體吸收后留下氯化氨， 能夠減少后期鹽酸的使用； (5) 由于草酸鋼中的C2〇42^能夠與巧、儀、銘、儘等多種金屬離子進行結合，而在發酵液 中存在著多種金屬離子，因此通過草酸鋼能夠除去發酵液中存在的金屬離子，提高產物純 度，增強安全性和有效性； (6) 在板框的過濾介質上預涂活性炭，從而起到助濾的作用，避免因待過濾的懸浮液中 顆粒太小將濾板的空隙堵住，從而影響正常過濾。在過濾過程中，在一次板框上預涂的活性 炭和二次板框上預涂的活性炭會有部分進入后續步驟中，但是由于需要采用活性炭進行脫 色，因此不會對產物的純度造成影響，反而能夠助濾提高產物的收率和純度； (7) 對培養基的組分的選擇和比例進行優化設計，并通過工藝控制使各個組分之間發 揮協同作用，提高萬古霉素的收率和純度。
【附圖說明】
[0017] 圖1為工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0018] W下結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0019] 本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其并不是對本發明的限制，本領域技術人 員在閱讀完本說明書后可W根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本 發明的權利要求范圍內都受到專利法的保護。 表1實施例1-6為培養基的組分表
[0020] 將實施例1-5的培養基均按照如下的制備方法進行制備： 步驟1:按照重量份，稱取或者量取各組分； 步驟2:量取用水量的2/3，加熱至沸騰。將碳源和剩余的1/^3水混合攬拌，然后倒入上述 沸水，繼續加熱，至碳源完全溶化，降到室溫下加入氮源、無機鹽和氨基酸復合物，攬拌溶 解； 步驟3:加入pH調節劑，調節pH至7.2。
[0021] 實施例6的培養基的制備方法與實施例1-5的培養基區別在于步驟2中未加入氨基 酸復合物，步驟3中不加入抑調節劑調節pH。
[0022] 參照圖1，實施例7 -9為萬古霉素的制備 實施例7 選用按照實施例1制備的培養基。
[0023] 步驟1:搖瓶種子接種、種子罐萬古霉素培養基培養、發酵罐萬古霉素培養基培養 得到萬古霉素發酵液。將萬古霉素發酵液置于預處理罐中，控制轉速為80rad/min，溫度為 25°C，加入發酵液體積的0.1 %的質量分數為10%的鹽酸進行成鹽，攬拌30min得到預處理 液。
[0024] 步驟2:陶瓷膜過濾，選用多通道陶瓷膜，通道數為10,其膜材質為二氧化娃，孔徑 為0.2皿。采用錯流模式進行循環過濾，壓力控制為0.1 MPa。
[0025] 步驟3:經過陶瓷膜過濾后進入一次納濾機組，納濾采用孔徑為0.5nm的芳香聚酷 胺復合納濾膜;納濾過程中，壓力控制在2.2MPa，濾液溫度控制在25°C，納濾的流速控制在 400LA，納濾的濃縮體積倍數為4倍，納濾結束，采用純化水頂洗lOmin。
[0026] 步驟4:經過一次納濾后進入草酸沉淀罐，再加入一次納濾得到的濃縮液重量的 0.001 %的固體草酸鋼，攬拌時間50min后靜置。
[0027] 步驟5:進入一次板框過濾除去草酸沉淀罐中的沉淀，板框中過濾介質為濾板，濾 板上預涂有2mm的助濾劑活性炭。
[0028] 步驟6:進入一次過柱純化，一次過柱純化采用SP825樹脂。
[0029] 步驟7:將一次過柱純化得到的洗脫液進入二次納濾機組，納濾采用孔徑為0.5nm 的芳香聚酷胺復合納濾膜;納濾過程中，壓力控制在2MPa，濾液溫度控制在25°C，納濾的流 速控制在4(K)LA，納濾的濃縮體積倍數為4倍，納濾結束，采用純化水頂洗lOmin。
[0030] 步驟8:進入一次結晶罐中進行一次結晶，加入二次納濾得到的濃縮液的重量10倍 的乙醇，起始溫度控制為45°C，終點溫度為15°C，降溫速度為3°C/min。
[0031 ]步驟9:進入二次板框過濾得到一次結晶體，板框中過濾介質為濾板，濾板上預涂 有2mm的助濾劑活性炭。
[0032] 步驟10:將二次板框過濾得到的一次結晶體加入活性炭脫色罐，加入去離子水溶 解，攬拌并加熱，待一次結晶體的溶液沸騰時加入一次結晶體重量的6%的活性炭進行脫色 30min〇
[0033] 步驟11:進入脫色板框進行脫色，脫色板框中過濾介質為濾板，濾板上預涂有2mm 的助濾劑活性炭。
[0034] 步驟12:將脫色板框中得到的過濾液進入二次過柱純化，二次過柱純化采用 服20SS樹脂。
[00巧]步驟13:進入超濾機組，超濾采用中空纖維超濾膜組件，超濾時，控制壓力ο. IMPa。
[0036] 步驟14:進入Ξ次納濾機組，納濾采用孔徑為0.5nm的芳香聚酷胺復合納濾膜;納 濾過程中，壓力控制在2MPa，濾液溫度控制在25°C，納濾的流速控制在4(K)L/h，納濾的濃縮 體積倍數為4倍，納濾結束，采用純化水頂洗lOmin。
[0037] 步驟15:進入二次結晶罐中進行二次結晶，加入Ξ次納濾得到的濃縮液的重量10 倍的乙醇，起始溫度控制為45°C，終點溫度為15°C，降溫速度為3°C/min。
[0038] 步驟16:真空抽濾至干燥。
[0039 ]步驟17:將真空抽濾得到的二次結晶體加入溶解罐中，加入二次結晶體重量12倍 的去離子水，攬拌30min至二次結晶體完全溶解形成溶解液。
[0040]步驟18:置于冷凍干燥機內，-45°