一種靈芝酸高產工程菌株kmust-FPS的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程和代謝工程領域，通過基因工程對靈芝酸代謝途徑中的法尼 基焦磷酸合成酶（FPS )基因過表達的方法，構建了一個靈芝酸高產的工程菌株。
【背景技術】
[0002] 靈芝（Ganoderma lucidum )是擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌。靈芝真菌在 我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應用靈芝作為藥物已有 兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調節血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護 肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價值，靈芝的有效成分分析和藥理 學研究已經引起了國際上的廣泛關注，尤其在日本、美國、韓國等國家。目前，靈芝的研究已 經深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學特性、栽培技 術、藥理學作用及臨床應用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結構中含有羧基的三萜類物質，從結構來看它屬于高度氧化的 羊毛留烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝 酸被分離出來。它們多為四環三萜類化合物，含有30個碳原子，結構中一般都有羥基，在紅 外光譜中有較強的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現多個波長的特征吸收，多數是在250 nm、237 nm、365 nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，抑制小鼠肝肉瘤 (HTC )細胞的增殖;護肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強其解毒作用;抗HIV;降血壓;抗 氧化;抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮痛，抑制真核細胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋 白轉移酶活性和促進體液免疫功能等作用。
[0004]法尼基焦磷酸合成酶（FPS )基因是靈芝酸合成途徑中的一個重要的基因。靈 芝酸是通過甲羥戊酸途徑合成的，這條途徑普遍存在于動物、植物、真菌。首先甲羥戊酸經 甲羥戊酸激酶（MVK )、甲羥戊酸5-磷酸激酶（PMK )和焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MDD) 三步酶促反應轉化為異戊二稀焦磷酸（IPP)。IPP在法尼基焦磷酸合成酶farnesyl diphosphate synthase ( FPS )的催化下轉化成法尼基焦磷酸。法尼基焦磷酸在藍稀合 成酶（SQS )的催化下合成鯊烯，然后經過鯊烯單加氧酶(SE)的作用產生鯊烯2, 3-氧化 物，再經過羊毛留醇合酶（LS )的作用產生羊毛留醇；最后通過不同酶的修飾作用產生 不同結構的靈芝酸;靈芝酸的合成途徑如下所示：
[0005] 由于野生靈芝生長周期長，受環境因素影響大且野生靈芝資源有限，靈芝菌絲培 養成為生產活性物質的重要方法。隨著對靈芝活性物質需求的不斷增加，如何提高靈芝酸 的產量和增加靈芝的有效成分越來越引起人們的關注。液體深層發酵技術是進行快速工業 化生產的重要手段。現在市售的靈芝酸主要是從靈芝子實體和液體深層發酵得到的菌絲體 中獲得。由于野生靈芝液體深層發酵時靈芝酸在靈芝細胞中的含量較低，分離純化也較難， 限制了對靈芝酸的活性、作用機理的研究及其廣泛應用。近年來，基因工程與代謝工程迅速 發展，成為了現代分子育種的重要手段。通過分子克隆和基因拼接等分子生物學方法來改 造菌株的基因組，從而提高活性成分的含量越來越受學者們的青睞。如何從分子水平上提 高靈芝酸的產量是目前急需解決的技術問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是解決野生型靈芝菌株自身產靈芝酸較低的問題，提供一種靈芝酸 高產菌株，該菌株為高產靈芝酸的靈芝（Ganoderma lucidum )工程菌kmust-FPS，已于 2015年10月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.11402。
[0007] 本發明靈芝酸高產工程菌株的構建方法如下： 以PMD19-T為起始載體并使用靈芝本身的強啟動子P-gpd、終止子T-sdhB、cbx基因 ，cbx 基因（具有carboxin抗性）是來自靈芝本身的抗性基因，其特點是在蘑菇類擔子菌的轉 化體系中同源標記基因的轉化效率更高，能夠穩定遺傳，抗性強。
[0008] 1、將靈芝啟動子p-gpd與終止子T-sdhB與PMD19-T連接，將靈芝cbx抗性基因插入 到Pst I酶切位點，從而構建成pJW-EXP載體;其具有靈芝的強啟動子和終止子，并具有靈芝 本身的抗性。
[0009] 其中擴增靈芝強啟動子P-gpd的引物序列為： P-gpd-F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3,， P-gpd-R:5 '-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3 '； 擴增靈芝sdhB基因終止子的引物序列為： T-sdhB-F: 5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，， T-sdhB-R : 5'-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3'； 擴增靈芝cbx抗性基因的引物為： cbx-F:5 '-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3 '， cbx-R:5 '-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3 '； 2、 靈芝酸合成途徑中關鍵酶法尼基焦磷酸合酶（FPS )從靈芝基因組中克隆（所 用的引物為FPS-Nhe-F和FPS-Sma-R )，并插入到pJW-EXP載體中，得到pJW-EXP-tFPS載體； 引物序列為： FPS-Nhe-F:5GCTAGCATGGCCGATGCAAAGGCTCAG- 3' FPS-Sma-R:5'_ CCCGGGTCACTTCTGCCGCTTGTAGATCTTGTC- 3'； 3、 通過PEG介導原生質體融合的方法，將pJW-EXP-tFPS轉化到野生型靈芝細胞中，以 carboxin作為抗性來篩選靈芝轉化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上篩選出轉化子； 4、 將轉化子在carboxin抗性的CYM平板中進行傳代培養； 5、 靈芝細胞的液體培養： PDA培養基（g/L ):葡萄糖10、瓊脂20、硫酸鎂1.5、磷酸二氫鉀3、維生素 B1 0.05和 制備好的土豆汁。
[0010] 土豆汁的制備方法:將200 g去皮新鮮土豆切成小塊，加入去離子水1.0 L煮沸30 min，用八層紗布過濾，取濾液，用于PDA培養基的配制。
[0011]種子培養基（g/L ):葡萄糖35、蛋白胨5、酵母膏2.5、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂0.5和 維生素 B1 0.05。
[0012]發酵培養基（g/L ):蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、維生素 B1 0.05,乳糖35,起始pH 5.5。
[0013] CYM培養基（g/L ):葡萄糖20、麥芽糖10、酵母粉2、蛋白胨2、MgS〇4 0·5、ΚΗ2Ρ〇4 4.6、瓊脂 10。
[0014]斜面培養:接種菌絲于土豆汁-葡萄糖-瓊脂（PDA )斜面中28 °C培養5-7天。 [0015] 一級種子培養:在250 mL搖瓶中添加40 mL培養基和10 mL菌絲體懸液（從一支 斜面中獲得），并在30 °C，120 rpm下培養5天。
[0016] 二級種子培養:在250 mL搖瓶中加入45 mL培養基和5 mL-級種子培養液（大約 500 mg DW/L，一級培養物用玻璃珠打碎后接種），在30°C，120 rpm下培養2天。
[0017] 發酵培養:在250 mL搖瓶中加入45 mL發酵培養基和5 mL二級種子發酵液（大約 500~600 mg DW/L，二級培養物用玻璃珠打碎后接種），在30°C，120 rpm下培養。
[0018] 6、單體靈芝酸的分離和提取 準確稱取干細胞粉末100 mg，加入3 mL 70%(v/v)乙醇浸泡過夜，超聲處理3次，每次30 min。10000 rpm離心5 min后獲得上清液。在50°C烘箱中烘干。用200 yL色譜級甲醇徹底溶 解，用0.22 μπι濾膜過濾，用HPLC檢測靈芝酸單體，HPLC檢測條件為:HPLC色譜柱為C18柱 (Agilent 1200 series，5 μπι Agilent Zorbax SB-C18 column，250X4.6 mm);進樣量 20 μΜ流速1 mL/min;流動相A為甲醇/乙酸（100:0.5(v/v))，流動相B為超純水，0-20 min:A 相為80%-100%等梯度洗脫;20 11^11-30 11^114相為100%洗脫;30 11^11-35 11^114相為80 %洗脫；紫外檢測波長為245 nm;洗脫時間35 min，記錄相應的峰面積和出峰時間，按照標 準曲線計算出各個靈芝酸單體的濃度和含量。
[0019] 本發明的優點和技術效果:通過搖瓶發酵實驗表明，FPS轉化子菌株產單體靈芝酸 GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分別是WT菌株的1.1，2.0，1.54，1.9倍。在同等情況下，使用 本發明構建的工程菌株可以節約勞動力，縮短生產周期，降低成產成本。因此，本高產菌株 可以作為生產靈芝酸的工程菌株，適用于工業化生產，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明中靈芝基因組；圖中：G為靈芝基因組，Μ為λ-Hind III digest DNA Marker； 圖2為本發明中pJW-EXP載體結構示意圖； 圖3為本發明中擴增FPS基因的電泳圖；圖中:Μ為500bp DNA Ladder(Dye Plus)的核酸 標準品（Takara ) ;F為FPS基因； 圖4為本發明中pJW-EXP-tFPS載體結構示意圖； 圖5為本發明中驗證FPS陽性轉化子的電泳圖；圖中：Μ為DL2000的核酸標準品（ Takara )，Ρ為陽性對照，FPS為轉FPS基因的陽性轉化子，WT為野生型菌株，Ν為陰性對照。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容并不局限于此，本 實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規試劑 或按常規方法配置的試劑。
[0022] 實施例1: pJW-EXP載體的構建 1、靈芝基因組DNA的提取 稱取約0.2 g凍干野生型靈芝（CCGMC 5.0616 )的菌絲體在液氮中研磨成粉末，將 粉末轉入1.5 mL經65°C預熱的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨）抽取緩沖液中，65°C保 溫30 min，然后在4°C下，10000 g離心20 min，取上清液加等體積的氯仿：異戊醇（24:1 )的混合物，輕輕搖勾30 min以上，4 °C下、10000 g離心20 min;將上清液移入1.5 mL離心 管后，加入2/3體積經-20 °C預冷的異丙醇，輕輕搖動5 min，用玻璃棒撈出DNA后，用75%的 乙醇洗滌2-3次，