多種病原菌平行檢測的滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測領(lǐng)域，具體涉及多種病原菌平行檢測的滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料 生物傳感器，還涉及利用該生物傳感器對多種病原菌平行檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 快速準(zhǔn)確檢測病原菌的種屬，對于臨床感染性疾病的診斷和后續(xù)治療至關(guān)重要。 目前在臨床微生物學(xué)中，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)后的酶學(xué)和生化反應(yīng)特性的診斷方法仍被廣泛采 用，這種經(jīng)典方法雖然準(zhǔn)確但是往往隨需時間較長，通常在細(xì)菌分離培養(yǎng)后還需要1-7天來 進(jìn)行復(fù)雜的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)才能準(zhǔn)確獲取病原菌的類型。雖然近年來出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解 吸電離-飛行時間質(zhì)譜被稱為革命性的細(xì)菌鑒定方法，可在細(xì)菌培養(yǎng)后省略了生化反應(yīng)實(shí) 驗(yàn)，直接通過細(xì)菌特異性的電荷比來區(qū)分不同類新致病菌，其只能檢測單一類型樣本無法 檢測混合樣本。雖然熒光PCR方法可以通過多種熒光標(biāo)記同時檢測幾種病原菌，熒光染料間 的干擾影響其檢測特異性。因此，建立一種快速無標(biāo)記的、可同時檢測多種病原菌的方法對 于臨床感染性疾病的診斷具有非常重要的意義。
[0003] 太赫茲(Terahertz，THz)福射是指頻率為0.1~ΙΟΤΗζ的電磁波，由于其波段位于 微波和紅外之間，相比于紫外可見吸收光譜、X射線成像分析等傳統(tǒng)技術(shù)，THz光譜有其獨(dú)特 的優(yōu)勢。太赫茲超材料是指與其相互作用為THz波段電磁波的新型人工材料，可對THz波的 振幅和相位等進(jìn)行靈活的控制。金屬開口諧振環(huán)(SRR)是目前最常見的超材料結(jié)構(gòu)類型，如 果把SRR看作為一個電感電容電路元件，超材料的共振頻率即可表示
其中L和C分別是電感和電容。電感主要是所制備超材料的幾何參數(shù)所決定，而電容與電容 器的有效介電常數(shù)密切相關(guān)。當(dāng)超材料表面覆蓋物質(zhì)后或者物質(zhì)改變后，其局域有效介電 常數(shù)的改變會引起電容的改變，從而導(dǎo)致其共振頻率的改變。因此，可通過檢測太赫茲超材 料共振頻率的位移來實(shí)現(xiàn)微量標(biāo)本的檢測。
[0004] 滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)是一種恒溫的DNA擴(kuò)增過程，避 免了傳統(tǒng)PCR的復(fù)雜熱循環(huán)帶來的非特異性擴(kuò)增和不兼容性等技術(shù)缺陷。RCA可在固相載體 上實(shí)現(xiàn)捕獲探針的固定，同靶序列雜交后，建立生物傳感器芯片表面的滾環(huán)擴(kuò)增系統(tǒng)。但 是，目前RCA主要通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，周期長，結(jié)果穩(wěn)定性差。
[0005] 因此，急需一種結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠在較短周期內(nèi)完成多種病原菌的平行檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供多種病原菌平行檢測的滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲 超材料生物傳感器;本發(fā)明的目的之二在于提供利用所述滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳 感器快速平行檢測多種病原菌的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 1、多種病原菌平行檢測的滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器，所述生物傳感器 包括太赫茲超材料、包被于太赫茲超材料反應(yīng)區(qū)的識別不同病原菌的捕獲探針和聚苯乙稀 玻片，所述聚苯乙烯玻片覆蓋于太赫茲超材料上層并且形成用于液相擴(kuò)增反應(yīng)的液膜腔 隙。
[0009] 本發(fā)明中，太赫茲超材料由硅基底上周期性排列的金屬開口諧振環(huán)組成，硅片為 470μηι厚，娃片上的金膜為200nm厚，每個周期由五個金屬開口諧振環(huán)所組成。優(yōu)選的，將太 赫茲超材料分為為5個獨(dú)立反應(yīng)區(qū)域。
[0010] 本發(fā)明中所述液膜腔隙的高度優(yōu)選為50μπι。
[0011] 本發(fā)明中，所述不同病原菌為大腸埃希菌、糞腸球菌、痢疾志賀菌、肺炎鏈球菌、表 皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中的至少一種。
[0012]優(yōu)選的，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID Ν0.7~12所示。
[0013] 更優(yōu)選的，還包括滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板，所述環(huán)形模板由不同病原菌的待檢測模 板序列與相匹配的鎖式探針通過連接酶連接形成的環(huán)形DNA分子。
[0014] 最優(yōu)選的，所述待檢測模板序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.13~18所示，所述鎖 式探針為5'端經(jīng)磷酸基修飾的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1~6所示的序列。
[0015] 2、利用所述滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器快速平行檢測多種病原菌的方 法，包括如下步驟：
[0016] (1)根據(jù)不同病原菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)與不同病原菌的待檢測模板序列項(xiàng)匹配 的鎖式探針和特異識別待檢測模板序列的捕獲探針，所述鎖式探針能夠與待檢測模板序列 連接形成滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板；
[0017] (2)將不同病原菌培養(yǎng)后，提取不同病原菌的基因組DNA;
[0018] (3)將鎖式探針分別加入到含不同病原菌的基因組DNA的連接反應(yīng)體系中連接，使 待檢測模板序列與鎖式探針形成滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板；
[0019] (4)向步驟(3)所得含滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板的反應(yīng)體系中分別加入Phi29 DNA聚合 酶，dNTPs混合液以及BSA;然后分別加入包被識別相應(yīng)病原菌捕獲探針的太赫茲超材料反 應(yīng)區(qū)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；
[0020] (5)將滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的生物傳感器采用太赫茲時域光譜儀在18~25°C采用透射模 式進(jìn)行測量，光路中配置有密閉裝置并沖入高濃度氮?dú)馐箼z測池相對濕度降至2%以下;并 以高阻硅的透射光譜作為樣本的參考信號;在RCA反應(yīng)前后分別測量太赫茲超材料反應(yīng)區(qū) 的透射光譜，根據(jù)共振頻率位移判斷不同病原菌。
[0021] 本發(fā)明中，所述病原菌為大腸埃希菌、痢疾志賀菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表 皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌中的至少一種。
[0022]優(yōu)選的，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.7~12所示;所述模板序列的核 苷酸序列如SEQ ID N0.13~18所示，所述鎖式探針為5'端經(jīng)磷酸基修飾的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1~6所示的序列。
[0023]更優(yōu)選的，所述步驟(3)為將鎖式探針分別加入到含不同病原菌的基因組DNA的連 接反應(yīng)體系中至鎖式探針終濃度為100nM，95°C變性5min后冰浴lmin，然后置于45°C水浴箱 中雜交反應(yīng)20min;隨后加入DNA連接酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 %的BSA，37°C條件下連接45min， 在連接產(chǎn)物中加入核酸外切酶反應(yīng)體系再加入?ου的exonuclease I和exonuclease III， 37°C反應(yīng)15min后，95°C，5min滅活外切酶。
[0024] 發(fā)明的有益效果:本發(fā)明公開了滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器，通過將將太 赫茲超材料和RCA有機(jī)結(jié)合，通過設(shè)計(jì)六種常見致病菌的DNA的鎖式探針(Padlock Probe， PLP)，特異識別基因組靶序列，通過連接酶連接成環(huán)形DNA分子，作為滾環(huán)擴(kuò)增的環(huán)形模板， 其靶序列與固定在超材料上的捕獲探針雜交，實(shí)現(xiàn)了原位復(fù)制擴(kuò)增。由于DNA分子的有效擴(kuò) 增、分子鏈延長，導(dǎo)致超材料表面的有效介電常數(shù)發(fā)生改變，使得太赫茲超材料的共振頻率 發(fā)生位移。當(dāng)在超材料表面不同區(qū)域中分別固定特定病原菌的捕獲探針后，從而可以通過 監(jiān)測太赫茲超材料特定區(qū)域的反應(yīng)前后的共振頻率的改變檢測特定類型的病原菌。由于不 同類新病原菌的擴(kuò)增反應(yīng)在同一片超材料的不同區(qū)域進(jìn)行，從而可以通過監(jiān)測不同區(qū)域反 應(yīng)前后共振頻率的改變實(shí)現(xiàn)同時多種病原菌的平行檢測。其反應(yīng)快速靈敏，可實(shí)現(xiàn)3小時內(nèi) 對六種臨床常見病原菌的平行檢測。
【附圖說明】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0026] 圖1為太赫茲超材料結(jié)構(gòu)的光鏡不意圖。
[0027] 圖2為滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028] 圖3為滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器的原理示意圖。
[0029] 圖4為RCA反應(yīng)前后太赫茲超材料共振頻率的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0031] 用于多種病原菌平行檢測的滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器，包括太赫茲超 材料、包被于太赫茲超材料反應(yīng)區(qū)識別多種病原菌的捕獲探針和聚苯乙烯玻片，所述聚苯 乙烯玻片覆蓋于太赫茲超材料上層并且形成用于液相擴(kuò)增反應(yīng)的液膜腔隙，液膜腔隙高度 約為50μπι;其中太赫茲超材料結(jié)構(gòu)如圖1所示，由硅基底上周期性排列的金屬開口諧振環(huán)組 成，娃片為470μηι厚，娃片上的金膜為200nm厚，每個周期由五個金屬開口諧振環(huán)所組成，太 赫茲超材料由現(xiàn)有光刻技術(shù)制備（圖1)。為檢測不同的模板，將超材料分隔多個獨(dú)立地反應(yīng) 區(qū)域，如本實(shí)施例分為6個獨(dú)立的反應(yīng)區(qū)域，分別包被檢測不同病原菌的捕獲探針(圖2)。
[0032] 利用滾環(huán)擴(kuò)增-太赫茲超材料生物傳感器平行檢測多種病原菌的方法，具體步驟 如下：
[0033] (1)探針及模板設(shè)計(jì)：以大腸埃希菌(E. col i )、糞腸球菌(E. faecal is)、痢疾志賀 菌(S · dysenteriae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、金黃色 葡萄球菌(S.aureus)6種菌作為檢測對象