蛋白熒光定位檢測系統及其快速檢測蛋白相互作用的方法和應用

蛋白熒光定位檢測系統及其快速檢測蛋白相互作用的方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術和基因工程技術領域，涉及一種通過蛋白熒光定位快速檢測 蛋白質相互作用的方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白相互作用網絡是生物信息調控的主要表現形式，是決定細胞生命活動的關鍵 因素。闡釋蛋白質之間的相互作用關系，是理解細胞的生物學活性、蛋白的信號轉導機制及 生物代謝等等生命過程至關重要的一環，能為確定蛋白質在整個生命過程中所辦扮演的作 用提供決定性的線索。
[0003] 目前蛋白相互作用的研究方法最常用的方法有免疫共沉淀（C 〇 _ immunoprecipitation，Co-IP)、酵母雙雜交系統(Yeast Two-Hybrid System)、焚光共振能 量轉移（Fluorescent Resonant Energy Transfer ,FRET)、雙分子焚光互補（Bimolecular Fluorescent Complement，BIFC)等。但是，不同的方法都存在不同的優缺點，比如免疫共沉 淀法操作復雜、不能保證沉淀的復合物為直接相互作用蛋白；酵母雙雜交方法只能驗證細 胞核內的相互作用，并且容易出現假陽性;雙分子熒光互補和熒光共振能量轉移方法操作 相對較為簡單、方便，但是存在假陽性較多的問題。因此仍舊需要對研究蛋白相互作用的方 法加以改進。

【發明內容】

[0004] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種蛋白熒光定位檢測系統及其快速檢測蛋白 相互作用的方法，該方法能夠在細胞水平上快速檢測蛋白的相互作用。
[0005] 本發明采取的技術方案如下：
[0006] 1、用于檢測蛋白間相互作用的蛋白熒光定位檢測系統，所述蛋白熒光定位檢測系 統由四種融合蛋白組成：（1)熒光蛋白A和待測蛋白A組成的融合蛋白；（2)熒光蛋白A、核定 位信號和待測蛋白A組成的融合蛋白；（3)熒光蛋白B和待測蛋白B組成的融合蛋白；（4)熒光 蛋白B、核定位信號和待測蛋白B組成的融合蛋白；
[0007] 所述熒光蛋白A與熒光蛋白B的熒光顏色不同；所述待測蛋白A和待測蛋白B為待檢 測是否存在相互作用的兩個蛋白。
[0008] 優選的，所述熒光蛋白、核定位信號和待測蛋白順次連接。
[0009] 優選的，所述熒光蛋白A、B為紅色熒光蛋白或綠色熒光蛋白。
[0010]優選的，所述紅色熒光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述綠色熒光蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述核定位信號序列如SEQ ID No.3所示。
[0011] 2、上述蛋白熒光定位檢測系統中任一種融合蛋白的編碼基因。
[0012] 3、含有上述蛋白熒光定位檢測系統中任一種融合蛋白的編碼基因的重組表達載 體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。
[0013] 優選的，所述重組表達載體為Piz-V5/His載體，所述重組菌為大腸桿菌DH5a，所述 轉基因細胞系為家蠶卵巢細胞系BmN-SWUl。
[0014] 4、上述蛋白熒光定位檢測系統在檢測蛋白相互作用中的應用。
[0015] 5、上述編碼基因在檢測蛋白相互作用中的應用。
[0016] 6、上述重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒在檢測蛋白相互作用中的 應用。
[0017] 本發明的有益效果在于:本發明蛋白熒光定位檢測系統基本原理示意圖如圖13所 示，本發明通過利用具有核定位信號和沒有核定位信號的綠色熒光蛋白及紅色熒光蛋白構 建四個熒光蛋白融合表達載體，若被研究的蛋白之間存在相互作用，則具有熒光標記的融 合蛋白就會被另外一個蛋白拉入細胞核內或被拉出細胞核;若被研究的蛋白之間沒有相互 作用，則被研究的熒光標記的融合蛋白定位不會發生變化。該方法可以在細胞中檢測兩個 都具有核定位信號的蛋白之間的相互作用、一個具有核定位信號的蛋白和一個沒有核定位 信號蛋白之間的相互作用以及兩個都沒有核定位信號的蛋白之間的相互作用。另外，該方 法消除了先前熒光雙分子互補技術和熒光共振能量轉移的假陽性問題。
【附圖說明】
[0018] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0019] 圖 1 為pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和pIZ-DsRed 構建示意圖；
[0020] 圖 2 為pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和pIZ-DsRed 表達載體轉染到BmN-SWUl細胞中后焚光蛋白的不意圖；標尺為5ym;
[0021 ] 圖3為pIZ-LEFl I-DsRed和核定位信號突變的Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed單獨轉染 細胞后的焚光蛋白定位不意圖；標尺為5ym;
[0022] 圖 4 為pIZ-LEFl I(KlOOL)-DsRed和 pIZ-EGFP、pIZ-LEFl I-EGFP分別共轉染后的熒 光蛋白定位不意圖；標尺為5ym;
[0023] 圖5為免疫共沉淀驗證對Piz-LEFl I(KlOOL)-DsRed和pIZ-LEFll-EGFP相互作用的 進一步驗證結果；
[0024] 圖6為LEF-I IN端截短載體構建示意圖；
[0025] 圖7為LEF-IlN端截短載體的細胞定位示意圖;標尺為5μπι;
[0026] 圖8為LEF-IlN端截短載體和pIZ-LEFll-EGFP共同轉染后，熒光蛋白定位分析示意 圖；標尺為5μηι;
[0027] 圖9為BIFC對LEF-I IN端截短載體和pIZ-LEFl I-EGFP相互作用的進一步驗證示意 圖；標尺為5μηι;
[0028] 圖10為本發明所述蛋白熒光定位檢測系統在研究兩個不具有核定位信號的蛋白 細胞定位和加上核定位信號的示意圖；標尺為1〇μπι;
[0029] 圖11為蛋白熒光定位檢測系統在一個蛋白加上核定位信號后共定位示意圖；標尺 為IOym;
[0030] 圖12為蛋白熒光定位檢測系統鑒定兩個不具有核定位信號蛋白的相互作用進一 步免疫共沉淀的驗證結果；
[0031] 圖13為蛋白熒光定位檢測系統基本原理示意圖。
【具體實施方式】
[0032] 本發明以研究家蠶核型多角體病毒(BmNPV)中的復制關鍵因子LEF-Il的自身相互 作用作為實施例2,鑒定兩個同時具有核定位信號蛋白之間相互作用的檢測方法；以 BmNPVLEF-11自身核定位和多聚化特征為實施例3，鑒定一個具有核定位信號和一個不具有 核定位信號的蛋白之間相互作用的檢測方法；以家蠶細胞中Gem2基因的相互作用蛋白為實 施例4,鑒定兩個都沒有核定位信號的蛋白之間的相互作用檢測的方法。
[0033] 下面將結合附圖，對本發明3個具有不同核定位方式的蛋白之間的相互作用實例 進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆 實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 [0034]需要說明的是，本發明所述內容中以NSL表示核定位信號，DsRed表示紅色熒光蛋 白，EGFP表示綠色熒光蛋白。
[0035]實施例1、蛋白熒光定位檢測載體構建
[0036]登陸NCBI數據庫，下載目前已知的表達DsRed和EGFP蛋白的核苷酸序列，其序列分 別如SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示，根據口12-￥5/把8(11^丨廿(^611公司）載體的多克隆位 點設計具有核定位信號序列和不具有核定位信號序列的相應引物，然后送華大基因合成， 引物序列如下：
[0043] 核定位信號序列如SEQ ID No.3所示。
[0044] 如圖1示意圖所示，將合成的引物根據相應的模板擴增并通過Hind III和Kpn I酶 切連接到經過相應酶切的pIZ_V5/His載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，然 后用含有博來霉素 (Zeocin)的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，酶切驗證正確 后使用。
[0045] 將構建好的 pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ-EGFP 和 pIZ-DsRed 表達載體轉染 到BmN-SWUl細胞中，轉染后48小時，用I XI3BST輕洗細胞3次，每次5min，然后加入質量分數 為4 %的多聚甲醛溶液，室溫固定15min，用I XI3BST輕洗細胞3次，每次5min;加入細胞核染 料DAPI，37°C避光處理20min，用1 \?831'輕洗細胞3次，每次5111丨11。最后取出蓋玻片在 Olympus激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照，結果如圖2所示。結果顯示具有核定位信號的 EGFP和DsRed蛋白能夠定位到細胞核內，不具有核定位信號的EGFP和DsRed蛋白在細胞核和 細胞質都有分布，證明構建系統可以用于后續實驗。
[0046]實施例2、蛋白熒光定位檢測系統鑒定蛋白相互作用的驗證
[0047]由實施例1構建的蛋白熒光定位載體，能夠定位到相應的位置，為了驗證這個系統 能夠以熒光定位變化觀測兩個蛋白間是否存在相互作用，首先分析LEF-Il具有核定位信 號，選擇PlZ-EGFP和pIZ-DsRed為目標載體，構建了LEF-11 (序列如SEQ ID No.4所示)全長 融合DsRed和EGFP的載體pIZ-DsRed-LEFl 1/pIZ-EGFP-LEFl 1，同時構建了突變LEF-11 第 100 位的核定位信號關鍵氨基酸突變體序列如SEQ ID No.5所示;融合DsRed的載體pIZ-LEFll (KlOOL)-DsRed，對照載體為pIZ-EGFP。載體構建方法同實施例1，所有載體測序正確后使 用。
[0048]將以上載體 pIZ-DsRed-LEFl 1 和 Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed 分別轉染到BmN-SWUl 細 胞中，轉染后48小時，熒光觀察這些熒光蛋白表達載體的定位，結果如圖3所示，由圖3可知， 熒光定位結果與推測結果一致，PlZ-DsRed-LEFll定位到細胞核內，而pIZ-LEFll(K100L)-DsRed由于缺失了核定位信號，定位到細胞質內，說明LEF-11確實具有核定位信號。
[0049] 將以上熒光蛋白融合表達載體Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed分別和載體pIZ-EGFP、 p IZ-EGFP-LEF11共同轉染到細胞中，轉染48小時后熒光觀察結果如圖4所示，由圖4可知， Piz-LEFll(KlOOL)-DsRed的定位確實因為和pIZ-EGFP-LEFll共同轉染發生了變化，定位到 細胞核內，但和PIZ-EGFP共同轉染的細胞定位并沒有發生變化，這一結果說明本發明所述 系統確實可以通過觀察蛋白的熒光定位檢測蛋白之間的相互作用。
[0050] 為了更進一步確認系統的準確可靠，進一步通過免疫共沉淀進行驗證，把pIZ-LEFlI(KlOOL)-DsRed和pIZ-EGFP-LEFll分別共轉染到BmN-SWUl細胞中，轉染48h后收集細 胞，加入ImL含PMSF的細胞IP裂解液重懸細胞，冰浴裂解30min;吸出IOOyL含有胞內蛋白的 裂解混合物作總蛋白組，剩余900此轉到兩個1.5mL離心管，每管450yL裂解混合物，并分別 加入2yLDsRed抗體(實驗組)和2yL小兔IgG(對照組），4°C輕微搖晃孵育6-8h;分別在兩個離 心管中加入60yL protein A+G蛋白磁珠，4°C孵育8h;4°C3000r/min離心5m