一種多肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽領域，特別涉及一種多肽的制備方法。
【背景技術】
[0002] Velcalcetide，也稱AMG 416,氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，結構如式I所示。
[0004] Velcalcetide用于接受透析的慢性腎病患者的繼發性甲狀旁腺功能允進。這個藥 物目前正在進行III期研究，預期2014年下半年將公布研究數據。
[0005] 安進公司目前已經有一個同一適應癥藥物在市場上銷售，名為Sensipar。去年，這 個藥物的銷售額同比增長14. 6%，達到10. 9億美元。
[0006] Velcalcetide可以在進行血液透析的同時通過靜脈給藥，這對于每天都需要使用 大量藥物的慢性腎病患者來說是一個福音。因此，velcalcetide很有可能會超過它的前任 Sensipar。分析師預期velcalcetide的年銷售峰值出現在2023年，為10億美元。
[0007] 目前未見合成方法的報道，更未見大規模合成的方法。因此，提供Velcalcetide 的制備方法具有現實意義。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此，本發明提供一種多肽的制備方法。該方法為純固相工藝，操作簡便，假 稀釋效應避免了液相反應中存在的多肽鏈間二硫鍵錯配的反應（不會產生肽鏈間反應）。 提高了多肽Velcalcetide的收率和純度，減少了副反應的發生。
[0009] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0010] 本發明提供了一種多肽的制備方法，包括如下步驟：
[0011] 步驟1 :取Arg與樹脂偶聯，制得Arg-樹脂；
[0012] 步驟2 :取所述Arg-樹脂，逐個偶聯Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，將氮端氨 基乙酰化，得到第一肽樹脂；
[0013] 步驟3 :脫除所述第一肽樹脂中Cys (X)的側鏈保護基X，再與Y-Cys偶聯，獲得第 二肽樹脂，裂解，即得。
[0014] 具體的，本發明提供的多肽的制備方法中，步驟2具體為取所述Arg-樹脂（具體 為 D-Arg(pbf)-Resin)，逐個偶聯 D_Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D_Ala、 D-Cys (X)，將氮端氨基乙醜化后，得到第一膚樹脂為Ac-D-Cys (X) -D-Ala-D-Arg (pbf) -D-Ar g(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Resi n〇
[0015] 具體的，本發明提供的多肽的制備方法中，第二肽樹脂為
[0017] 在本發明的一些實施例中，Cys的側鏈保護基所述X為mmt或mtt。適于做側鏈 保護基的均在本發明的保護范圍之內，本發明在此不做限定。作為優選，Cys含有特殊的側 鏈保護基Npys，一方面防止合成原料之間的二硫鍵合成，另一方面Npys屬于良好的離去基 團，能有效提高原料與鏈間Cys的偶聯。
[0018] 在本發明的一些實施例中，步驟3中所述脫除選用體積濃度為1 %~5% TFA的 DCM 溶液，即 1 % ~5 % TFA/DCM。
[0019] 在本發明的一些實施例中，所述Y為Fmoc、Boc或H。適于做保護基的均在本發明 的保護范圍之內，本發明在此不做限定。
[0020] 在本發明的一些實施例中，當所述Y為Fmoc時，步驟3中所述獲得第二肽樹脂與 所述裂解之間還包括脫除Y的步驟。當所述Y為Boc或H時，不需要先脫除。
[0021] 在本發明的一些實施例中，所述脫除Y選用的脫除劑為體積濃度為20%哌啶的 DMF溶液，即20 %哌啶/DMF。
[0022] 作為優選，步驟3中的偶聯反應條件是空氣氧化。
[0023] 在本發明的一些實施例中，步驟3中所述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、 TIS和H2O的混合物。作為優選，TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O的體積比為83:5:5:5:2。
[0024] 在本發明的一些實施例中，步驟1中所述樹脂為氨基樹脂，所述氨基樹脂選自 Rink Amide ResiruRink Amide-MBHA Resin 或 Rink Amide-AM Resin。
[0025] 在本發明的一些實施例中，步驟3所述裂解后還包括純化的步驟。
[0026] 作為優選，Fmoc-D-Arg-Resin 的替代度為 0· 2 ~0· 5mmol/g。
[0027] 作為優選，樹脂與Fmoc-D-Arg(pbf)的摩爾比為1. 6:1-4:1。
[0028] 作為優選，偶聯劑為HOBt/DIC。
[0029] 作為優選，反應后經封閉液封閉8h，封閉液中吡啶與乙酸酐的摩爾比為1:1。
[0030] 在本發明的一些實施例中，Fmoc-D-Arg-樹脂與Fmoc-D-Ala-OH的摩爾比至少為 1:3,優選的，Fmoc-D-Arg-樹脂與Fmoc-D-Ala-OH的摩爾比為1: 3。
[0031] 在本發明的一些實施例中，以g/mL計，樹脂與裂解液的質量體積比為1:10。作為 優選，裂解劑中TFA/PhSMe/EDT/TIS/H 20的體積比為83:5:5:5:2。
[0032] 在本發明的一些實施例中，粗肽精制成時，加入的酸為硫酸胺、三氟乙酸或醋酸。 作為優選，硫酸胺的濃度為0.05%，pH值為2. 5。作為優選，三氟乙酸的濃度為0.1%。作 為優選，醋酸的濃度為〇. 1%。
[0033] 本發明提供一種多肽的制備方法。該方法為純固相結合進行大規模制備的 Velcalcetide路線，利用固相的假稀釋效應避免了液相反應中存在的多肽鏈間二硫鍵錯 配的反應。具體為采用了特殊的合成原料Boc-Cys(Npys)-OH或Fmoc-Cys(Npys)-OH或 H-Cys (Npys) -OH，含有特殊的側鏈保護基Npys，一方面防止合成原料之間的二硫鍵合成， 另一方面Npys屬于良好的離去基團，能有效提高原料與鏈間Cys的偶聯。提高了多肽 Velcalcetide的收率和純度，減少了副反應的發生。
【附圖說明】
[0034] 圖1示實施例13制備的精肽的RT-HPLC色譜圖；
[0035] 圖2示實施例13制備的精肽的質譜圖；
[0036] 圖3示多肽Velcalcetide標準品的質譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 本發明公開了 一種多肽的制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改 進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯 而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了 描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行 改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0038] 本發明提供的多肽的制備方法中所用氨基酸及試劑均可由市場購得。
[0039] 縮寫及英文含義
[0040] 縮寫及英文 含義
[0041] Fmoc 9_荷甲氧撰基
[0042] DIPCDI 二異丙基碳二亞胺
[0043] HOBt 1-羥基苯并三唑
[0044] DMF N, N-二甲基甲酰胺
[0045] DCM 二氯甲烷
[0046] TFA 三氟乙酸
[0047] PhSMe 苯甲硫醚
[0048] TIS 三異丙基硅烷
[0049] EDT 乙二硫醇
[0050] Boc-Cys (Npys) -OH Boc-S-(3_ 硝基 _2_ 批陡基硫）_L_ 半脈氛酸
[0051] Fmoc-Cys (Npys) -OH Fmoc-S-(3_ 硝基 _2_ 批陡基硫）_L_ 半胱氨酸
[0052] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0053] 實施例1 :替代度為0. 5mmol/g的Fmoc-D-Arg(pbf)-氨基樹脂的合成
[0054] 稱取替代度為1.0 mmol/g的Rink Amide resin 400g，加入到固相反應柱中， 用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。用DBLK (20 %哌啶/DMF)脫除Fmoc保護， 然后用 DMF 洗滌 4 次，DCM 洗 2 次。稱取 162. 2g Fmoc-D-Arg (pbf)-OH(250mmol)和 40. 5g HOBt (300mmol)溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入46. 9ml DIC(300mmol)活化3min后加入固相反應柱中，室溫反應2小時。用DMF洗滌3次，加入 1395. Iml封閉液（吡啶/乙酸酐=I: l，8mol :8mol)封閉8小時（樹脂若未完全擴散加 DCM作為溶劑）。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽干，得到Fmoc-D-Arg (pbf) -Rink Amide樹脂。用常規固相替代度檢測方法檢測替代度為0. 502mmol/g。
[0055] 以替代度為1.0 mmol/g的Rink Amide-MBHA resin