黃藤素衍生物及其在制備抗阿爾茨海默病的藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種從天然中藥中獲得的黃藤素衍生物的制備方法，確切的說是一種 以中藥提取的化學成分為先導化合物，制備一系列衍生物，以抗阿爾茨海默病活性為目的 進行結構修飾，屬于醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默癥(AlzheimeV s disease，AD)是一種中老年常見的以漸行性記憶力 減退、認知功能障礙、人格改變為特征的中樞神經系統退行性疾病，且隨著世界人口老齡化 的加劇，全球老年癡呆癥病人已經超過3500萬，將帶來諸多的社會和經濟問題。因此對AD的 防治已成為十分迫切的社會與醫學問題。目前AD治療藥物種類繁多，已上市或正在進入臨 床研究的藥物有乙酰卡尼汀、他可林、維那克林、水飛薊素、毒扁豆堿等，其藥品毒副作用都 較大，且多為對癥治療，療效不確切、特異性不強、毒副作用大、不易透過血腦屏障等，限制 了其臨床應用，因此開發高效低毒老年性癡呆防治藥物一直是國內外醫藥界的研究熱點。 [0003] 黃藤素是從中藥黃藤(Fibraurea recisa Pierre.)中經醇提取，Di〇i、ODS柱分離 純化獲得的一種異喹啉類生物堿化合物。我們的研究已經證明了黃藤素具有抗阿爾茨海默 病的藥理活性(專利公開號:CN104873503A)。因此，本發明的目的在于對黃藤素進行結構改 造，制備一系列衍生物，以期尋找對阿爾茨海默病有更強治療作用的新的生物堿類化合物。
[0004] 在本發明完成之前，還沒有文獻報道黃藤素衍生物具有抗阿爾茨海默病的作用， 也未發現黃藤素衍生物在制備抗阿爾茨海默病藥物中應用的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明在于提供一種以黃藤素為先導化合物合成一系列具有抗阿爾茨海默病作 用的黃藤素衍生物。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案得以實現：
[0007] 1、乙醇提取中藥黃藤(Fibraurea recisa Pierre.)，經純化、分離而獲得的化合 物5,6_二氫-2,3,9，10-四甲氧基二苯并[a，g]喹嗪內鑰（5,6-(1讓 7(^〇-2,3,9，10-tetramethoxy_dibenzo[a，g]quinolizinium)，即化合物1 (黃藤素）。
[0009] 2、化合物1在160-180°c真空條件下熱解20min，冷卻至室溫，用硅膠柱分離(三氯 甲烷：甲醇:氨水=8:1:0.1)得暗紅色的晶體，即得化合物2，該化合物結構式為：
[0011] 3、化合物2溶于CH2C12中，緩慢滴加各種酰氯，再加入三乙胺，常溫條件下攪拌，待 反應完全，減壓回收溶劑，干燥，得粗產物。粗產物先用乙醚洗脫，再用硅膠柱分離純化(三 氯甲烷：甲醇=8:1 )，得黃色粉末的化合物3-17。
[0013] 表1各衍生物的化學結構
[0014]
[0017] 以上所述的各種具有抗阿爾茨海默病的黃藤素衍生物，可用于制備治療阿爾茨海 默病的藥物。
[0018] 本發明的特點為:對天然產物黃藤素進行化學修飾，得到一系列與黃藤素結構相 似的衍生物，首次經酶學及細胞試驗證明，具有較好的治療阿爾茨海默病作用，且一些衍生 物的活性優于母體化合物黃藤素及陽性藥鹽酸多奈哌齊，體現了本發明的先進性及創新 性。
[0019] 黃藤素及衍生物的藥理作用，通過以下藥效學實驗得到證實的。
[0020] 細胞人神經母細胞瘤細胞購自上海中科院細胞所。
[0021] 藥品及試劑黃藤素及其衍生物為實驗室自制；陽性對照藥鹽酸多奈哌齊由衛材 藥業有限公司制造（140322A)。乙酰膽堿酯酶由上海源葉生物科技有限公司生產u 200U/ g)〇
[0022] 1.黃藤素衍生物體外抑制乙酰膽堿酯酶活性試驗
[0023]乙酰膽堿酯酶(AChE)溶液的配制：100U的乙酰膽堿酯酶被溶解于50mL的Tris-HCl (0.05M，pH=7.8)緩沖液中，再加入50mg的小牛血清蛋白穩定酶液，即得2U · ml/1的酶溶液。 2U · mL-1的酶液用pH=8.0的PBS稀釋成0.5U · mL-1的酶液供Ellman法使用。
[0024] 2mM DTNB的配制：3.96mg DTNB先用500yL的無水乙醇溶解，再加1.5mg NaHC03,然 后用pH=7 · 0的PBS定容到5mL。
[0025] 15mM ATCI的配制：21.67mg ATCI加蒸餾水溶解并定容至5mL。
[0026] 鹽酸多奈哌齊溶液的配置:5mg的鹽酸多奈哌齊溶解在5mL的pH = 8.0的PBS中，充 分震蕩配成lmg · mL-1的溶液，然后依次用pH = 8.0的PBS稀釋成500yg · mL-UsOyg · mL一\ lOOyg · mL-· mL-ijSyg · mL-1 的待用溶液。
[0027] 各衍生物溶液的配置:取各衍生物，準確稱重，用pH=8.0的PBS溶液溶解配成濃度 為 100yg · mL-1 的溶液，然后用ρΗ=8·0的PBS稀釋成50yg · mL-\25yg · mL-^lOyg · mL-\5μ g · mL-ij.Syg · mL-· mL-1 的待用溶液。
[0028] 樣品孔:在酶標板小孔中加入140yL PBS緩沖液(0.1M，pH=8.0)，20yL待測樣品溶 液和15yL酶溶液，混合均勻后在4°C保存20min。取出加入10yL DTNB(2mM)和10yL ATChl (15mM)，在37°C反應20min后即可在405nm讀取吸光度值。樣品本底對照孔:用15yL PBS緩沖 液代替15yL酶溶液，其它條件不變。空白對照孔：用20yL PBS緩沖液代替20yL待測樣品溶 液，其它條件不變。
[0029] 實驗結果見表2。衍生物3、10、13的抑制活性最好，較陽性對照藥鹽酸多奈哌齊及 先導化合物具有更強的抑制活性。
[0030] 表2各衍生物的1(：50值
[0031]
[0032] 2.黃藤素衍生物對Αβ25-35誘導人神經母細胞瘤細胞株細胞(SH-SY5Y)損傷的神經 保護作用
[0033] SH-SY5Y細胞株按常規方法傳代培養，取對數期生長的細胞，按1.5Χ 105個/孔接 種于96孔板，放入37°CC〇2培養箱中，使之完全貼壁。棄去舊培養液，在各孔中加入各樣品溶 液，濃度梯度分別設置為5、10、25、50、100yg · ml/1，每種濃度均為三個復孔，孵育12h。吸去 舊培養液，將20mi〇 1 /mL Αβ25-35加入各濃度梯度樣品溶液的細胞孔中，并共同孵育24h;再次 吸去舊培養液，每孔20yL 5mg · mL-1的MTT溶液，37°C孵育4h，棄去液體，每孔加入200yL DMS0，震蕩15min。用酶標儀在570nm下測定吸收值。本實驗