結合人類補體因子c2的結合分子及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫/生物化學領域。本發明涉及用于抑制補體系統的經典激活途徑 和凝集素激活途徑的活化的手段和方法，及其在治療人類病癥中的應用。本發明涉及補體 因子的抑制因子及其應用。本發明具體涉及與人類補體因子C2結合的結合分子，及其在治 療或預防補體活化介導的疾病或障礙(諸如抗體介導的炎癥性疾病和缺血性病癥中的缺 血-再灌注(I/R)損傷）中的應用。
【背景技術】
[0002] 補體系統包括在血液中循環的蛋白。補體因子作為無活性的前體蛋白進行循環。 所述系統的活化導致活化級聯，其中，通過級聯中進一步下游的補體蛋白的特異性蛋白水 解作用，一個因子活化隨后的因子。補體系統屬于所謂的血漿級聯系統。補體系統參與宿主 針對入侵微生物的防御。
[0003] 可經由三種途徑發生補體系統的活化:經典激活途徑、凝集素激活途徑和替代激 活途徑。每一條途徑都活化核芯組分C3或第三補體因子，這使得引起膜攻擊復合體的形成 的常見末端途徑活化(]^111161^&61'11&1(1，41111111^￥13;[001161111988,57:321)。在補體活化過 程中，生成幾種炎癥性肽(如過敏毒素 C3a和C5a)，以及膜攻擊復合體C5b-9。這些活化產物 激發多效的生物效果，諸如白細胞的趨化性，吞噬細胞、肥大細胞和嗜堿粒細胞的脫粒，平 滑肌收縮，脈管滲透性升高，和細胞裂解(Hugl i，Complement 1986，3:111)。補體活化產物 尤其通過吞噬細胞，還誘導有毒的氧自由基的生成，以及花生四烯酸代謝物和細胞因子的 合成和釋放，這進一步放大炎癥應答。
[0004] 盡管補體是針對病原微生物的防御的重要線路，它的活化也可能傷害其他健康的 宿主細胞。補體介導的組織損害在很多炎癥性疾病中都起作用，這些炎癥性疾病包括敗血 癥、免疫復合體病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡和脈管炎、多發性創傷、幾種神經病 (諸如多灶性運動神經病）、缺血-再灌注（I/R)損傷(諸如在心肌梗塞等的過程中出現的缺 血-再灌注（I/R)損傷）。補體活化在這些病癥中的致病作用是它的活化產物的上述一種或 多種生物效果的結果。因此，抑制補體活化在這些病癥中是有利的。
[0005] 可通過天然抑制因子，抑制補體的活化，其中天然抑制因子在上述級聯的幾個水 平上控制活化。這些抑制因子包括:C1_抑制因子，其抑制經典激活途徑和凝集素激活途徑 的活化的早期步驟;Η因子和C4結合蛋白，其分別使C3-轉化酶和C4-轉化酶解離，并且充當 降解C4b和C3b的I因子的輔因子;發揮與Η類似功能的調節膜蛋白CR1、DAF和MCP;以及，抑制 MAC的血衆蛋白玻連蛋白和凝聚素（clusterin)和膜蛋白CD59(Sahu et al.，Immunol Resl998，17:109;Campbell et al.，Annu Rev Immunoll988,6:161)。
[0006] 抑制補體活化是一有吸引力的治療選擇。實際上，已經生產出幾種作為重組蛋白 的內源性可溶的補體抑制因子(C1-抑制因子;可溶的補體受體1或sCRl)，并且在臨床研究 中進行了評價。另外，還評價了抑制級聯反應中諸如C5的關鍵蛋白（Thomas et al.，Mol Immuno 1 1 996，33 : 1 389 )的抗體的給藥。一種這樣的抗體，Solirisg).或依庫麗單抗 (eculizumab)，是抗C5的抗體。目前已批準使用所述抗體來治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿 癥和非典型溶血性尿毒綜合征。
[0007] 補體的作用是促進對入侵微生物的吞噬作用。因此，抑制炎癥性疾病中的補體具 有提高感染風險的固有缺點。凝集素激活途徑和替代激活途徑的補體活化可通過微生物直 接活化，而經典激活途徑通過與諸如微生物的抗原結合的IgG或IgM抗體活化。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種與人類補體因子C2結合的結合分子。在一個實施方式中，所述 結合分子包括免疫球蛋白重鏈可變區和免疫球蛋白輕鏈可變區：
[0009] (a)所述免疫球蛋白重鏈可變區和免疫球蛋白輕鏈可變區分別包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:2和SEQIDN0:3 ;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQID N0:11 ;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQ ID N0:27; SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35;或者，SEQ ID N0:98和SEQ ID N0:35;或者
[0010] (b)所述免疫球蛋白重鏈可變區和免疫球蛋白輕鏈可變區分別包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:99和SEQIDN0:103 ;SEQIDN0:99和SEQIDN0:104;SEQIDN0:99和SEQ IDN0:105 ;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:106;SEQIDN0:10(^PSEQIDN0:103;SEQIDN0: 100和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106; SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:101和SEQ IDN0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103 ;SEQID NO:102和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;或SEQ ID NO:102和SEQ ID NO: 106;或者
[0011] (c)所述免疫球蛋白重鏈可變區和免疫球蛋白輕鏈可變區包括在(a)和/或(b)中 具體限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列中的一個或兩者包括1~5個氨基酸替換。
[0012] Olglesby等人(J Immunol 1988,2:926)描述了一種C2特異性抗體。使用去糖基化 且變性的C2免疫小鼠，來鑒定出抗體。使用天然糖基化的C2進行免疫不產生適當的C2特異 性抗體。US2001/0026928中也記載了一種C2特異性抗體。其中開發的抗體針對C2的C2a亞組 分。其中沒有公開所述抗體所識別的表位的進一步細節。
[0013] 本發明的結合分子在結合在C2上的表位是不同的。在本發明之前，并不知曉在C2 上存在更多失活表位。
[0014] 本發明的結合分子抑制補體活化，并且可用于治療多種疾病。本發明提供了一種 預防或治療由補體活化介導的疾病，所述方法包括將本發明的結合分子對有需要的個體給 藥。本發明進一步提供本發明的結合分子，用于預防或治療由經由經典激活途徑和/或凝集 素激活途徑的補體活化介導的疾病或障礙。
[0015] 這樣的疾病的實例是炎癥性疾病、神經疾病或缺血-再灌注（I/R)損傷。在本發明 的上下文中，優選的神經疾病是神經-炎癥性疾病。本發明的結合分子不完全抑制補體。它 至少留下補體系統的一些能力，以抵御微生物入侵。本發明的結合分子至少使替代的補體 活化途徑保持基本完整。本發明的結合分子這一特征普遍改善了本發明的補體抑制因子， 尤其是基于補體抑制因子的抗體的治療適用性。根據本發明的治療的優選實例是腎同種異 體移植的抗體介導的排斥、特發性膜性腎病、免疫溶血性貧血、免疫復合體病、缺血-再灌注 病癥(諸如缺血-再灌注損傷）。本發明的結合分子是用于多種治療性干預的有吸引力的選 擇，因為它們有效限制體內補體系統的活性的結果，同時降低由于對微生物感染和/或增殖 的敏感性而產生的副作用的風險。
[0016] 在一個實施方式中，本發明的結合分子與C2a結構域的表位結合。本發明的C2a結 合分子有效抑制C2。盡管事實是這樣的結合分子不完全抑制C1的剪切，但令人驚奇地是，它 們仍然是有效的。本發明的C2a結合分子使C2b與C4b的結合保持完整。盡管如此，本發明的 C2a結合分子顯著抑制了 C2的活性。
[0017] 在一個實施方式中，本發明的結合分子與C2b結構域的表位結合。盡管事實是這樣 的結合分子不完全抑制C1的剪切，但它們仍然是有效的。本發明的C2b結合分子使C2a與C4b 的結合保持完整。盡管如此，本發明的C2b結合分子顯著抑制了 C2的活性
[0018] 在優選的實施方式中，本發明的結合分子與部分存在于C2a結構域上且部分存在 于C2b結構域上的表位結合。本發明的結合分子與單獨的C2a和C2b結構域可檢測地結合。盡 管事實是本發明的這樣的C2a/C2b結合分子不完全抑制C1剪切，但令人驚奇地是，它們仍然 是有效的。盡管如此，本發明的C2a/C2b結合分子顯著抑制了 C2的活性。
[0019] 本發明的結合分子優選是Fab片段、單鏈Fv(SCFv)片段，或抗體或其抗原結合片 段。
[0020] 如本文所使用的，術語"包括重鏈可變區和輕鏈可變區的結合分子"涵蓋但并不限 于，抗體及其抗原結合片段。優選片段是Fab片段、scFv片段、單價抗體(unibody )、雙價抗 體、三價抗體等。
[0021] 本發明的結合分子與人類C2結合。在SEQ ID:N0 1中給出了優選的人類C2的氨基 酸序列。結合分子優選與人類C2特異性結合。這意味著，在天然人的樣品中，優選在人類血 漿的樣品中，結合分子結合超過95 %、優選超過99%的人類C2，并且與血漿中的其他的人類 蛋白相比，對C2具有20nM或更小的親和性。
[0022] C2的活化涉及蛋白剪切成較小的片段。通常將這些片段稱為C2a片段和C2b片段。 在本發明中使用的術語是，C2a片段是較大的約70kDa的片段。C2a片段與C4b形成復合體，從 而形成C3-轉化酶C4bC2a。這一復合體典型地是表面結合的。較小的約30kDa的N-末端C2b釋 放到流體相中。
[0023] 如在本文中使用的，術語"C2活性"或諸如此類的描述指C2蛋白在補體活化級聯中 的作用。當C2蛋白通過被C1進行蛋白剪切而活化，從無活性的前體酶轉變成有活性的絲氨 酸蛋白酶時，C2蛋白是"有活性的"。有活性的C2與C4b作為輔因子能活化C3,而與C4b和C3b 作為輔因子能活化C5。
[0024] 如在本文中使用的，術語"C2抑制"或諸如此類的描述也指其在補體活化級聯中的 作用。當C2活化信號（即C1)存在于它的環境中時，C2蛋白不執行其在級聯中的作用以活化 補體時，C2蛋白被"抑制"。
[0025] 術語"抗體"指單克隆抗體和多克隆抗體。可從動物的血液制備抗體。目前，更普遍 是通過細胞來制備抗體，其中由所述細胞中的核酸表達該抗體。有可使用的多種細胞和細 胞系。雜交瘤細胞系普遍用于生產鼠類的單克隆抗體。隨著重組DNA方式的到來，現今普遍 使用細胞系。優選的細胞系是PER. C6細胞系、CH0細胞系和NS0細胞系。上述抗體可以是單價 抗體、四價抗體或其他的多價抗體。典型地，上述抗體是如上所示的包括C2抗原結合位點的 單價抗體。
[0026] 在一個實施方式中，本發明的抗體是多特異性抗體。原型多特異性抗體是雙特異 性抗體。多特異性抗體包括兩個或更多個不同的抗原結合位點。在這樣的多特異性抗體中， 本發明的結合分子提供抗原結合位點中的至少一個。至少一個其他的抗原結合位點是直接 針對C2上的不同表位的抗原結合位點，或者優選地，直接針對不同分子上的表位的抗原結 合位點。其他抗原結合位點優選是抗體可變區。本發明的雙特異性抗體包括本發明的結合 分子，和對C2上的另一表位或不同分子上的表位具有特異性的至少一個其他的抗體可變區 (重鏈和輕鏈）。
[0027] 抗原結合片段(Fab片段)是抗體的與抗原結合的片段。它由所重鏈和輕鏈的每一 個的一個恒定結構域和一個可變結構域構成。這些結構域形成抗原結合位點。兩個可變結 構域與其特異性抗原上的表位結合。可在實驗室中生成Fab片段。目前，可提供的有多種酶， 從抗體上切出所述片段。在本發明中，術語Fab片段涉及單一的可變結構域Fab片段和含有 兩個可變結構域的F(ab'）2片段。術語Fab片段用于表示抗體分裂時的片段，以及由細胞表 達，從一個或多個編碼區直接產生類似的片段。
[0028] 如本文所使用的，術語"單鏈Fv"（也稱為scFv)指，通過分離結合抗體的結合結構 域(重鏈和輕鏈），并且補充允許保持結合功能的連接部分的經改造的抗體。這基本上形成 極端縮小的抗體，僅具有結合抗原所需的超變結構域的一部分。在例如US專利號4，946，778 (Ladner et al)中記載了單鏈抗體的測定和構建。
[0029] 如本文所使用的，術語"KD" (M)用于指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。
[0030] 分別具體為SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的重鏈可變區和輕鏈可變區，是抗體 5F2.4的重鏈可變區和輕鏈可變區。分別具體為SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11的重鏈可變 區和輕鏈可變區，是抗體13的重鏈可變區和輕鏈可變區。分別具體為SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的重鏈可變區和輕鏈可變區，是抗體32的重鏈可變區和輕鏈可變區。分別具體為 SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27的重鏈可變區和輕鏈可變區，是抗體35的重鏈可變區和輕鏈 可變區。分別具體為SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35的重鏈可變區和輕鏈可變區，是抗體60 的重鏈可變區和輕鏈可變區。具體為SEQ ID N0:96的輕鏈可變區，是抗體5F2.4的輕鏈可變 區的小鼠共有氨基酸序列。具體為SEQ ID N0:97的重鏈可變區，是抗體35的重鏈可變區的 小鼠共有氨基酸序列。具體為SEQ ID N0:98的重鏈可變區，是抗體60的重鏈可變區的小鼠 共有氨基酸序列。SEQ ID N0:99-102是5F2.4的人源化輕鏈可變區VL1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:103-106是5F2.4的人源化重鏈可變區VH1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:107-110是編 碼含人源化￥1^1，1^4的人源化1〇輕鏈5?2.4的〇0嫩序列(^〇10勵 ：111-114是編碼含人源化 VH1-VH4的人源化IgG4鏈5F2.4的cDNA序列。SEQ ID N0:115-118是編碼含人源化VL1-VL4的 人源化κ輕鏈5F2.4的氨基酸序列。SEQ ID N0:119-122是編碼含人源化VH1-VH4的人源化 IgG4鏈5F2.4的氨基酸序列。
[0031] 本發明的結合分子中的免疫球蛋白的輕鏈可變區或重鏈可變區可具有:有1~5個 氨基酸替換的SEQ ID 勵：2、3、10、11、18、19、26、27、34、35、96-106和115-122的氨基酸序 列。具有上述經替換的重鏈可變區、經替換的輕鏈可變區或兩者的本發明的結合分子，在種 類上(但不必在數量上)具有相同的C2抗原結合特征。所述結合分子結合至與原始結合分子 相同的表位。1~5個氨基酸替換能生成結合分子的去免疫化形式。典型地，可通過對重鏈的 最多5個位置、輕鏈的最多5個位置或兩者進行改變，來實現用于人類受試者的去免疫化。鼠 類可變區的去免疫化是已建立好的技術，總是產生在人體內誘導免疫應答的可能性減小的 結合分子。實現這一結果所需的氨基酸替換的數量典型地在每一條鏈中小于5。與未經改變 的序列相比，每一條鏈中1、2或3個氨基酸替換常常就足以獲得本發明在人體內誘導免疫應 答的可能性減小的結合分子。
[0032]在優選的實施方式中，本發明的抗體是人類抗體或人源化抗體。如本文所使用的， 術語"人類抗體"用于包括，具有來源于人種系的免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗 體。人類抗體可包括，不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，例如通過體外的隨 機或位點特異性誘變或通過體內的體細胞突變引入突變。
[0033] 如本文所使用的，術語"人源化抗體"指免疫球蛋白或經改造的抗體構建體的構架 區的至少一部分來源于人類免疫球蛋白序列。應當清楚的是，可使用使抗體或抗體構建體 人源化的任意方法，例如通過可變結構域的表面重塑(resurfacing) (Roguska et al.， Proc Natl Acad Sci U S A1994,91:969)或CDR嫁接或重構（Hurle et al.，Curr Opin Biotechnol 1994，5 :428)。在別的人類抗體構架背景中，人源化抗體優選包括抗體5F2.4、 13、32、35或60的⑶R區。因此，本發明還提供了一種人類抗體，該人類抗體包括具有SEQ ID N0:4-6的CDRl-3序列的人類重鏈可變區，和具有SEQIDN0:7-9的CDRl-3序列的人類輕鏈 可變區。當然嫁接的⑶R序列被適當放置，即SEQ ID NO:4的重鏈可變區的⑶R1區代替人類 抗體的重鏈可變區的⑶R1區，用于嫁接加工。SEQ ID N0:5的⑶R2區代替所述人類抗體的重 鏈可變區的CDR2區，等等。本發明還提供了一種人類抗體，該人類抗體包括具有SEQ ID N0: 12-14的CDR1-3序列的人類重鏈可變區，和具有SEQ ID勵:15-17的0?1-3序列的人類輕鏈 可變區。CDR區再次被適當放置。本發明還提供了一種人類抗體，該人類抗體包括具有SEQ ID NO:20-22的CDR1-3序列的人類重鏈可變區，和具有SEQ ID NO:23-25的CDR1-3序列的人 類輕鏈可變區。CDR區再次被適當放置。本發明還提供了一種人類抗體，該人類抗體包括具 有SEQ ID N0:28-30的CDR1-3序列的人類重鏈可變區，和具有SEQ ID N0:31-33的CDR1-3序 列的人類輕鏈可變區。CDR區再次被適當放置。本發明還提供了一種人類抗體，該人類抗體 包括具有SEQ ID NO:36-38的CDR1-3序列的人類重鏈可變區，和具有SEQ ID NO:39-41的 CDR1-3序列的人類輕鏈可變區。CDR區再次被適當放置。
[0034] 在優選的實施方式中，在包括抗體5F2.4的CDR的人類抗體中，人源化輕鏈可變區 包括任選經1~5個氨基酸替換的SEQ ID N0:99、100、101或102的序列。在優選的實施方式 中，在包括抗體5F2.4的CDR的人類抗體中，人源化重鏈可變區包括任選經1~5個氨基酸替 換的SEQ ID從):10