基于AllGlo探針的VKORC1基因多態性檢測分型試劑盒及其分型方法
【技術領域】
[00011本發明涉及單核苷酸多態性(SNP)，尤其是涉及一種基于AllGlo探針的VK0RC1基 因多態性檢測分型試劑盒及其分型方法。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。SNPs在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達 300萬個甚至更多。作為第三代遺傳標志，SNP與人體許多表型差異、藥物易感性與疾病易感 性密切相關。SNP在基因組中的大量存在，使其成為一個強有力的工具，在疾病定位與克隆、 藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究中起了非常重要的作用。
[0003] 個體化診斷治療是未來醫學發展的大方向。將個體化的靶點定位于某個基因，甚 至是單個核苷酸，發現疾病的遺傳標志物，將有助于根據每個患者的不同遺傳背景來開展 疾病預防、診斷和治療。基因的SNP是形成個體間差異的重要遺傳學基礎，通過SNP與疾病和 藥物治療的關聯性分析，使得醫生不僅可以通過所檢測出的SNP預測、確定與疾病有關的基 因，同時也將能夠事先把握患者個體對于某種藥物的反應特點，并根據這一特點選擇治療 效果最好，不良反應等危險性最小的藥物對患者進行精準治療。
[0004] SNP在疾病的預防、診斷、治療及個體化醫學發展中扮演著重要的角色，因此準確 快速的進行SNP檢測分型具有重大的意義。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接測序技術法、限制性片段長度多態性技術 (RFLP)、Tagman熒光探針法、擴增阻滯突變系統(ARMS)、高分辨熔解曲線分析法(HRM)等。其 中，直接測序法是目前最直觀，準確性相對而言最高的SNP分型方法，但其步驟多而分散，成 本較高，工作量大，周期長，價格昂貴，不適合大樣本多位點檢測;限制性片段長度多態性技 術(RFLP)作為一種最早的DNA標記技術，對儀器要求低，只需要一臺PCR儀以及電泳儀器即 可進行實驗，但其實驗操作繁瑣，檢測周期長，不適合大樣本檢測;Tagman熒光探針法準確 度較好，但其設計合成程序復雜，并且不適合多位點少量樣本的分型，尤其是頻率偏低的位 點；擴增阻滯突變系統(ARMS法)快速、簡便，但是不能閉管操作，對基因多態性分析難以實 現高通量、自動化;高分辨熔解曲線分析法(HRM)具有簡單、快速等優點，但該方法特異性不 足，儀器選擇少。
[0006] AllGlo探針作為新一代的熒光探針，在具備TaqMan-MGB探針優點的基礎上，大大 提高信噪比，減少背景熒光信號。目前，AllGlo探針已經成功應用于檢測皰疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突變（Feng，Z.L.Yu，X.Y.Lu，Z.M.Geng，D.Y.Zhang，L.Chen，S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta，2011，412( 11-12) :1018-1021 )、侵襲性曲霉菌病（Wu，D.S.Shen，J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 華法林是一類抗維生素 K類口服抗凝藥，臨床上被廣泛用于深靜脈血栓形成、肺栓 塞、房顫等抗凝治療，其作用機制是通過抑制維生素 K氧化還原酶復合體1 (VK0RC1)起作用。 個體間華法林有效劑量的敏感性差異是導致治療過程中出血和血栓形成的重要因素。研究 發現VK0RC1基因的單核苷酸多態性位點VK0RC1(1173C>T)分型為TT的病人僅需低劑量的華 法林就能保持安全有效的抗凝效果(D'Andrea G，D'Ambrosio RL，Di Perna P，Chetta PM, R.Santacroce R,Brancaccio V,et al. A polymorphism in the VKORClgene is associated with an interindividual variability in the dose-anticoagulant effect of warfarin· Blood · 2005; 105:645-9)。有報道顯示，在中國人群中VK0RC1 (11730 T)也是影響華法林敏感性的重要因素 (Miao L,Yang J,Huang C，Shen Z.Contribution of age,body weight,and CYP2C9and VKORClgenotype to the anticoagulant response to warfarin:proposal for a new dosing regimen in Chinese patients.Eur J Clin Pharmacol. 2007; 63:1135-1141)，因此在用藥前對患者進行VK0RC1(1173C>T)的檢測分型， 能夠為患者提供合適的治療劑量，避免給藥劑量不足或過度用藥，為臨床治療用藥提供重 要的參考依據。在個體化診斷與治療快速發展的背景下，VK0RC1 (1173C>T)與華法林個體劑 量差異的緊密聯系使其成為了一個極具醫學潛力的SNP位點，因此急需一種更快速高效的 SNP分型方法來滿足精準醫學的發展。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的之一在于針對現有檢測SNP方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的 上述缺陷及VK0RC1基因的單核苷酸多態性位點VK0RC1(1173C>T)，提供基于AllGlo探針的 VK0RC1基因多態性檢測分型試劑盒。
[0009] 本發明的目的之二在于針對VK0RC1基因的單核苷酸多態性位點VK0RC1(1173C>T) 提供基于AllGlo探針的VK0RC1基因多態性檢測分型方法。
[0010] 所述基于AllGlo探針的VK0RC1基因多態性檢測分型試劑盒，包括實時熒光定量 PCR試劑、陽性對照及陰性對照；
[0011]所述VK0RC1(1173C>T)為美國國家生物技術信息中心(NCBI)所提供人16號染色體 VK0RC1基因中的SNP位點。
[0012] 所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份：10 X Taq緩沖液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10μ mol/L VK0RC1(1173C>T)的特異正向引物、lOymol/L VK0RC1(1173C>T)的特異反向引物和 AllGlo探針；所述 10XTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013] 所述VK0RC1 (1173C>T)的特異正向引物的核苷酸序列為：
[0014] SEQ ID NO.1：5;-AAAGGTGATTTCCAAGAAGCCA-3;；
[0015] 所述VK0RC1(1173C>T)的特異反向引物的核苷酸序列為：
[0016] SEQ ID NOJj'-CAGTGACATGGAATCCTGACGT-S，。
[0017] 所述Al lGlo探針為VK0RC1 (1173C>T)的特異探針，其核苷酸序列為：
[0018] SEQ ID N0.3：VK0RC1(1173C>T)-A:MAR-AGTCCAAGAGTCGATG-MAR；
[0019] SEQ ID N0.4:VK0RC1(1173C>T)-G:JUP-AGTCCAAGGGTCGAT-JUP。
[0020] 所述陽性對照包括：陽性純合對照品1、陽性純合對照品2、陽性雜合對照品。所述 陽性純合對照品1為VK0RC1 (1173C>T)分型為AA的DNA樣品，所述陽性純合對照品2為VK0RC1 (1173C>T)分型為GG的DNA樣品，所述陽性雜合對照品為VK0RC1 (1173C>T)分型AG為的DNA樣 品。
[0021 ]所述陰性對照為lmL的無核酶水。
[0022] 所述基于AllGlo探針的VK0RC1基因多態性檢測分型方法，其步驟如下：
[0023] 1)采用常規方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探針的VK0RC1基因多態性檢測分型試劑盒提供的實時熒 光定量PCR試劑將DNA進行實時熒光定量PCR擴增；
[0025] 3)根據檢測到的熒光信號對人VK0RC1基因的單核苷酸多態性位點VK0RC1(1173C> T)進行分型。
[0026] 所述AllGlo探針可米用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探針，它擁有普通Taqman，Taqman_MGB及分子信標(molecular beacon)探針所有優點，克 服了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統Taqman-端報告基團一端淬滅基團的限 制，利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制焚 光染料，標記在寡核苷酸上面互為報告基團和粹滅基團，而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火溫度)的化學基團，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標 記的染料又全部變為報告基團，提高熒光增量。
[0027] 所述AllGlo探針具有以下優勢：
[0028] ①提高Tm值(可達10°C以上），探針更短可以達到15~16個堿基，可以適用A，T含量 比較高的序列設計探針；
[0029] ②加大了多重熒光定量的選擇，因為每種染料即是報告基團又是淬滅基團，打破 傳統Taqman探針因波長原因標記選擇困難，不受淬滅基團波長限制；
[0030] ③大大提高信噪比，無背景信號，空間距離近，更好的淬滅效果；
[0031 ]④成本較低，價格僅相當于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針所有優勢。
[0032]本發明采用了 AllGlo探針技術，設計了特異性引物和相應的AllGlo探針，探針分 別標記2種特殊熒