一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法，屬于水產生物技術領 域。
【背景技術】
[0002] 泥嫩（Misgurnus anguillicaudatus)和大鱗副泥嫩（Paramisgurnus dabryanus) 分別隸屬于鯉形目鰍科中的泥鰍屬和大鱗副泥鰍屬。這兩種鰍在我國分布廣泛，除我國西 部高原外，自南至北均有分布。因有著較高的食用和藥用價值，它們越來越受到消費者的喜 愛。近年來，隨著市場需求量的不斷增加，這兩種鰍類的野生資源量下降嚴重，導致了它們 的市場價格節節攀升，其市場經濟價值不可小覷。目前，國內已經掀起了一股泥鰍和大鱗副 泥鰍的養殖熱潮，大規模的生產使得優良的泥鰍和大鱗副泥鰍苗種的需求量迅速增加。然 而，目前水產市場上泥鰍種質資源混雜，純種與雜種難以分辨。如果使用育性較低的雜種作 為親本，從繁育的角度來說，會直接造成繁育場巨大的經濟損失。同時，鑒別出泥鰍和大鱗 副泥鰍的純種和雜種，是開展這兩種泥鰍選育和雜交育種工作的重要前提，這直接關乎到 育種工作的成功與否。
[0003] 微衛星標記，又稱簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSRs)，是目前為止 應用最為廣泛的分子標記之一。其應用主要分為三個方向：遺傳多樣性研究、品種鑒定和親 緣關系鑒定、以及遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位。線粒體DNA標記作為一種新型的分子工具， 擁有母系遺傳的特點并且缺乏修復重組能力。泥鰍在我國存在多種染色體核型，以二倍體 和四倍體為主。因此，在進行泥鰍的繁育工作時，倍性鑒定一直是一個重要的內容，目前，人 們多利用血液進行泥鰍倍性檢測，這對泥鰍的規格有一定的要求且對泥鰍也有一定的傷 害，如果能通過鰭條對泥鰍倍性進行判定，就能很好地解決上述的問題。
[0004] 近年來，國內泥鰍種質資源混雜，市場上出現了大量的泥鰍和大鱗副泥鰍雜種。目 前，雖有通過外部形態、分子標記等對泥鰍和大鱗副泥鰍進行鑒別的方法，卻至今沒有泥鰍 與大鱗副泥鰍純種和雜種的鑒別方法。為繁殖和培育出優良的泥鰍苗種，本發明旨在提供 一種鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法。
【發明內容】
[0005] 本發明針對目前泥鰍種質資源混雜、泥鰍與大鱗副泥鰍雜種大量出現的現狀，提 供了一種能夠鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種的方法。
[0006] 本發明包括:篩選出4個泥鰍特有的微衛星SSR標記（2價8、2附9、4階和4價7)、2個 大鱗副泥鰍特有的微衛星SSR標記(PD30和TO50)和1個已知可區分泥鰍和大鱗副泥鰍的線 粒體標記(MP)，設計以上7個標記的引物，并用該引物對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴 增，獲得PCR擴增產物并進行凝膠電泳分析。同時，本發明還用鰭條進行待測樣品的倍性檢 測，對倍性結果和凝膠電泳結果進行綜合分析，從而鑒別泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種。
[0007] 更加詳細的方法如下：
[0008] (1)取待測樣本，剪取部分尾鰭組織，將尾鰭組織分成兩份，一份黃豆大小的尾鰭 組織用于倍性檢測；另一部分的尾鰭組織存放在裝滿95%乙醇的1.5ml的離心管中，采用醋 酸銨/異戊醇法提取基因組DNA，然后用紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將樣品的質量濃度 稀釋至100ngAiL，-20°C保存備用；
[0009] (2)以步驟(1)中的黃豆大小的尾鰭組織為樣本，利用倍性分析儀進行倍性檢測；
[0010] (3)以步驟（1)中的DNA為模版，以7個標記的引物進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物， 然后進行凝膠電泳分析；
[0011 ]所述7個標記的名稱及其引物序列為：
[0012]
[0013] (4)對步驟(2)中獲得的倍性結果和步驟（3)中獲得的凝膠電泳結果進行綜合分 析，二倍體的樣本中，僅4個泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產物的樣本是二倍體 泥鰍罕X二倍體泥鰍Λ僅2個大鱗副泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產物的樣本 是大鱗副泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ在泥鰍和大鱗副泥鰍特有SSR標記都有擴增產物的情況 下，線粒體標記的擴增產物為大小285bp條帶的樣本是二倍體泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ而線 粒體標記的擴增產物為大小214bp條帶的樣本是大鱗副泥鰍罕X二倍體泥鰍Λ三倍體的樣 本中，在泥鰍和大鱗副泥鰍特有SSR標記都有擴增產物的情況下，線粒體標記的擴增產物為 大小285bp條帶的樣本是四倍體泥鰍罕X大鱗副泥鰍Λ而線粒體標記的擴增產物為大小 214bp條帶的樣本是大鱗副泥鰍罕X四倍體泥鰍Λ四倍體的樣本是四倍體泥鰍罕X四倍體 泥鰍Λ僅4個泥鰍特有的SSR標記和線粒體標記有擴增產物。
[0014]所述步驟(2)的倍性檢測方法為:加200yL細胞核提取液在黃豆大小的尾鰭組織樣 本上，刀片切割數次，然后加800yL細胞染色液，避光染色lmin，接著用30μηι濾網過濾，然后 用PBS定容至800yL上倍性分析儀檢測倍性。
[0015]步驟（3)中所述的PCR擴增的總體積為10yL，其中含lOOng/yL的模板DNA 0.5yL， 1 · OyL的 lOxBuffer，0 · 2yL的 10mmol/L dNTPs，0 · lyL的0 · 5IU/yL的Taq DNA聚合酶，lOnmol/ L正向及反向SSR引物各0.25yL，余量為雙蒸水。
[0016]步驟(3)中所述的PCR擴增的程序為:PCR循環參數為:94°C5min;然后30個循環，每 個循環包括94°C lmin，退火溫度下30s，72°C lmin;最后72°C5min延伸;然后4°C保存。
[0017] 步驟(3)中所述的凝膠電泳分析采用1.0 % -2.0 %的MetaPhor瓊脂糖凝膠上電泳。
[0018] 本發明與現有技術相比的優點：
[0019] 本發明所闡述的方法是基于4個泥鰍特有的微衛星SSR標記（2N18、2N19、4N7和 4N17)、2個大鱗副泥鰍特有的微衛星SSR標記(PD30和PD50)、1個已知可區分泥鰍和大鱗副 泥鰍的線粒體標記(MP)、以及1種用鰭條進行泥鰍倍性檢測的方法所建立的。利用本方法， 可高效且快速地對泥鰍與大鱗副泥鰍純種和雜種進行鑒別，為解決目前泥鰍市場種質資源 混亂局面提供了一種準確快捷的鑒別方法。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例一中隨機選擇的一條二倍體泥鰍純種的倍性檢測圖。
[0021 ]圖2為實施例一的泥鰍特有的SSR標記4N7的PCR產物電泳檢測部分結果，其中Μ為 DNA Mark I，DD1-DD5為二倍體泥鰍純種樣品，ΤΤ1-ΤΤ5為四倍體泥鰍純種樣品，ΡΡ1-ΡΡ5為 大鱗副泥鰍純種樣品，TP1-TP5為雜種TP樣品，PT1-PT5為雜種PT樣品。
[0022]圖3為實施例一中大鱗副泥鰍特有的SSR標記TO30的PCR產物電泳檢測部分結果， 其中Μ為DNA Mark I，DD1-DD5為二倍體泥鰍純種樣品，TT1-TT5為四倍體泥鰍純種樣品， PP1-PP5為大鱗副泥鰍純種樣品。
[0023]圖4為實施例一中線粒體標記MP的PCR產物電泳檢測部分結果，其中Μ為DNA Mark I，PD1-PD5為雜種ro樣品，DP1-DP5為雜種DP樣品。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述。
[0025] 實施例一：
[0026] 本實例所用的泥鰍與大鱗副泥鰍成魚購買自湖北省武漢市白沙洲水