一種活細胞內CdS量子點的合成方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種活細胞內CdS量子點的合成方法，屬于納米熒光材料技術領域。
【背景技術】
[0002]量子點是納米熒光探針的一種，具有優良的光譜性能，與有機熒光染料相比，更適合于醫學焚光成像。在傳統的化學合成方法中，有機金屬合成法由于有機試劑有毒，合成條件苛刻，并且需要進行復雜的水溶性處理環節才能運用到生物體內，給量子點的進一步應用帶來了困難。水相合成法操作簡單，重現性好，但是含鎘量子點的毒性問題一直倍受爭議。近年來，出現了大量使用生物有機體為載體進行納米材料合成的報道。這些報道中大多以細菌或真菌為載體，通過不同的條件與方法，合成了生物相容性良好的各種類型的量子點。
[0003]腫瘤細胞易于培養，增殖較快。有研究表明，腫瘤細胞中一些物質如谷胱甘肽等含量明顯高于正常細胞，而谷胱甘肽是量子點合成中優良的穩定劑及保護劑。細胞內部有著多種活動如生長、分裂等，這些活動可以促進離子間的相互反應，進而調節粒子的成核、生長。通過將一定濃度的離子與細胞共孵育，使其進入細胞內，在細胞的內環境下，以細胞生長代謝活動為動力，促進納米粒子的合成，不失為一種新型、綠色的合成方法。
[0004]HeLa細胞廣泛應用于腫瘤研究、生物實驗或者細胞培養，已經成為醫學研究中非常重要的工具。該細胞有以下幾大優點:與其它癌細胞相比，增殖異常迅速，且細胞株不會衰老致死，并可以無限分裂。
【發明內容】
[0005]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種活細胞內CdS量子點的合成方法，采用以宮頸癌HeLa細胞為載體，以細胞生長代謝活動為動力，以HeLa細胞內源性物質谷胱甘肽為穩定劑和保護劑，通過將鎘離子和硫離子先后與HeLa細胞共孵育后，使鎘離子和硫離子在細胞代謝活動的驅動下反應成核生成CdS量子點，再通過細胞裂解、破碎、離心等一系列方法處理，制得熒光穩定、性質優良的CdS量子點，其熒光發射波長為450 nm左右，為立方晶型結構，水溶液中量子點的尺寸大小約為3.0 n m;與現有技術相比，該量子點毒性小，生物相容性較傳統方法合成出的量子點大大提高，可直接用于生物體系。
[0006]本發明是通過如下技術方案實現的，一種活細胞內CdS量子點的合成方法，以宮頸癌細胞HeLa細胞為載體，利用細胞生命代謝活動為動力制備量子點，具體制備步驟如下:
步驟I)細胞培養:將HeLa細胞置于裝有完全培養基的培養瓶中，并放入培養箱(37°C，5%C02)中孵育至細胞密度為80%?90%。
[0007]步驟2)細胞與鎘離子共孵育:取出步驟I)裝有HeLa細胞的培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含鎘離子溶液，其鎘離子濃度為0.5-2.5 μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育2?6 h，制得含有鎘離子的HeLa細胞; 所述的含鎘離子溶液是向完全培養基中加入含鎘化合物配制含鎘離子溶液，并先后經0.45 μπ^Ρ0.22 μπι濾膜過濾制得。
[0008]步驟3)細胞與硫離子共孵育:取出步驟2)制得的含有鎘離子的HeLa細胞培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含硫離子溶液，其硫離子濃度為0.5-2.0 μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育4?32 h，制得含CdS的HeLa細胞;
所述的含硫離子溶液是向完全培養基中加入含硫化合物配制含硫離子溶液，并先后經0.45 μπ^Ρ0.22 μπι濾膜過濾制得。
[0009]步驟4)CdS量子點提取:用細胞刮刀將含CdS的HeLa細胞取出，轉移至離心管，10000 rpm離心10 min，用PBS洗滌兩次后收集細胞；向所收集的細胞中加入200?500 yLRIPA裂解液(強)，用細胞破碎機將細胞裂解20?40 min，HOOOrpm離心5min，取上清液。
[0010]步驟5)CdS量子點純化及表征:向步驟4)所得上清液內，加入異丙醇(上清液與異丙醇體積比為1:1-3)使CdS量子點沉淀，3000 rpm離心5 min，取沉淀；重復上述步驟三次后，將沉淀經冷凍干燥即得到量子點粉末;量子點經去離子水稀釋，測其光譜及結構性質。[0011 ] 各步驟中所述的完全培養基由90%DMEM高糖培養基和10%血清組成；
所述的DMEM高糖培養基的組成為:D-葡萄糖4.5g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，碳酸氫鈉3.7g/L，丙酮酸鈉0.110g/L，青霉素80 1]/1111，鏈霉素0.08 mg/ml。
[0012]所述的步驟I)中，細胞密度進一步優化為80%?85%，且處于對數生長期。
[0013]所述的步驟2)中含鎘化合物為氯化鎘或硝酸鎘。
[0014]所述的步驟3)中含硫化合物為硫化鈉。
[0015]所述的步驟2)，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育時間進一步優化為6h。
[0016]所述的步驟3)，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育時間進一步優化為12?30 h。
[0017]所述的步驟5)量子點采用異丙醇進行沉淀，上清液與異丙醇的體積比進一步優化為1:2。
[0018]所述的步驟2)中含鎘離子溶液和含硫離子溶液由完全培養基配制，并經0.45μπι和0.22 Mi的濾膜濾過，目的是為了防止細胞染菌，影響實驗結果。
[0019]本發明的有益效果在于:
(I)利用宮頸癌細胞HeLa細胞為載體，以細胞代謝活動為驅動力制備CdS納米量子點。由于對于應用于生物體內的量子點的生物兼容性要求較高，而現有的合成方法中，合成產物對生物體毒性較大，極易對生物體造成傷害。而生物法合成的量子點從細胞中合成，又應用到生物中去，其生物兼容性也大大提高，因此，可以達到某些醫療或診斷方面的要求。
[0020](2)利用腫瘤細胞內源性物質合成量子點。谷胱甘肽是量子點合成過程中常用的穩定劑及保護劑。相關研究表明，腫瘤細胞中谷胱甘肽含量明顯高于正常細胞。細胞的生長及分裂過程可以促進離子相互間的反應，進而調節粒子的成核、生長。通過將一定濃度的離子與細胞共孵育，使其進入細胞，在細胞內環境的作用下，以細胞生長代謝活動為動力可以促進納米粒子的合成。
[0021](3)操作簡單。只需要將鎘源和硫源先后加入細胞中孵育，無需特殊的實驗條件，簡單價廉。
[0022](4)應用方便。由于生物相容性較高，毒性較小，所以可以直接用于生物體系。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發明實施例2的CdS量子點的TEM圖；
圖2是本發明實施例2的CdS量子點XRD表征圖。
[0024]【具體實施方式】:
下面通過具體實施案例詳細說明本發明的技術方案，但保護范圍不被此限制。
[0025]實施例1:利用氯化鎘在HeLa細胞中合成CdS量子點具體合成步驟如下:
步驟I)細胞培養:將HeLa細胞置于裝有完全培養基的培養瓶中，并放入培養箱(37°C，5%C02)中孵育至細胞密度為80%，且處于對數生長期；
步驟2)細胞與鎘離子共孵育:取出步驟I)裝有HeLa細胞的培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含鎘離子溶液，其鎘離子濃度為1.5μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育6 h，制得含有鎘離子的HeLa細胞；
所述的含鎘離子溶液是向完全培養基中加入氯化鎘配制含鎘離子溶液，并先后經0.45μπ^Ρ0.22 μπι濾膜過濾制得；
步驟3)細胞與硫離子共孵育:取出步驟2)制得的含有鎘離子的HeLa細胞培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含硫離子溶液，其硫離子濃度為0.5 μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育12 h，制得含CdS量子點的HeLa細胞；
所述的含硫離子溶液是向完全培養基中加入硫化鈉配制含硫離子溶液，并先后經0.45μπ^Ρ0.22 μπι濾膜過濾制得；
步驟4)CdS量子點提取:用細胞刮刀將含CdS的HeLa細胞取出，轉移至離心管，10000rpm離心10 min，用PBS洗滌兩次后收集細胞；向所收集的細胞中加入200 yL RIPA裂解液(強)，用細胞破碎機將細胞裂解20 min，HOOOrpm離心5min，取上清液；
步驟5)CdS量子點純化及表征:向步驟4)所得上清液內，加入異丙醇(上清液與異丙醇體積比為I: 2)使CdS量子點沉淀，3000 rpm離心5 min，取沉淀;重復上述步驟三次后，將沉淀經冷凍干燥即得到量子點粉末;量子點經去離子水稀釋，測其光譜及結構性質；
所述的完全培養基由90%DMEM高糖培養基和10%血清組成；
所述的DMEM高糖培養基的組成為:D-葡萄糖4.5g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，碳酸氫鈉3.7g/L，丙酮酸鈉0.110g/L，青霉素80 1]/1111，鏈霉素0.08 mg/ml。
[0026]經檢測，制備的CdS量子點發射波長為451nm 實施例2:利用氯化鎘在HeLa細胞中合成CdS量子點具體制備步驟如下:
步驟I)細胞培養:將HeLa細胞置于裝有完全培養基的培養瓶中，并放入培養箱(37°C，5%C02)中孵育至細胞密度為85%，且處于對數生長期；
步驟2)細胞與鎘離子共孵育:取出步驟I)裝有HeLa細胞的培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含鎘離子溶液，其鎘離子濃度為1.0μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°C，5%C02)中孵育6 h，制得含有鎘離子的HeLa細胞；
所述的含鎘離子溶液是向完全培養基中加入氯化鎘配制含鎘離子溶液，并先后經0.45μπ^Ρ0.22 μπι濾膜過濾制得；
步驟3)細胞與硫離子共孵育:取出步驟2)制得的含有鎘離子的HeLa細胞培養瓶，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗HeLa細胞兩次后，加入新配制的含硫離子溶液，其硫離子濃度為1.0 μπιο?/百萬個細胞，置于培養箱(37°