花生逆境脅迫AhbHLH1L基因克隆及功能表達方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種花生逆境脅迫AhbHLHIL基因克隆及功能表達 方法。
【背景技術】
[0002] 花生富含油脂和蛋白，是我國重要的油料作物和經濟作物。花生的產量和品質受 干旱、鹽堿等脅迫影響非常嚴重，全國每年因干旱引起的花生減產率達20%以上。但由于花 生品種資源遺傳基礎狹窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐鹽的基因源，利用常規育種方法難以培 育出高抗品種。隨著分子生物學的快速發展，近年來利用轉基因技術提高植物脅迫耐受能 力的研究取得了顯著成果，對脅迫相關基因和信號轉導途徑也有了更深入的了解。
[0003] bHLH類轉錄因子是一類較大的轉錄因子家族。近年來，一些bHLH類轉錄因子在植 物逆境脅迫調控中可能發揮著重要功能。擬南芥的ICE1和ICE2均編碼bHLH類轉錄因子，二 者均作用于CBF/DREB轉錄因子的上游，在低溫脅迫下可以促進該類基因的表達，從而在擬 南芥對低溫的適應性中起到了關鍵作用。擬南芥中bHLH192基因的表達對干旱、高鹽及低溫 脅迫都有響應，在擬南芥中超表達該基因能夠提高轉基因植株對鹽脅迫的抗性。近年也發 現水稻中多個bHLH類轉錄因子在轉基因擬南芥或水稻中對轉基因植株對低溫、鹽或干旱脅 迫的抵抗能力方面具有積極的調控作用。目前花生中還沒有bHLH類轉錄因子克隆及功能研 究的報導，本研究通過芯片雜交發現該基因在花生鹽處理芯片中表達上調明顯，隨后對該 基因進行了基因克隆及功能研究。
【發明內容】
[0004] 為了提高花生生長的抗逆能力，增強其對高鹽、干旱和低溫脅迫的抗性，發明了一 種花生逆境脅迫相關基因 AhbHLHIL的克隆及功能表達方法。
[0005] -種花生逆境脅迫AhbHLHIL基因克隆及功能表達方法，主要包括以下步驟： (1)材料的準備與處理 材料為花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生種子在營養土和 蛭石以2:1混合的土中萌發，萌發后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗（28°C/22°C)。生長約2 周處于三葉期的花生幼苗用于后續的非生物脅迫處理； 低溫處理，將三葉期花生幼苗置于4°C光照培養箱中進行處理，分別于處理的0h，lh， 3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生葉片和根作為材料;對于耐鹽用NaCl處理;對于抗旱，用 PEG6000處理。將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡 在200mM NaCl或重量濃度20 %PEG6000溶液中，在處理時間為Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和 72h分別取花生的葉片和根作為材料。所有材料均保存于-80°C超低溫冰箱中備用。
[0006] (2)RNA的提取和cDNA的合成 本實驗用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分離提取花生幼苗RNAeRQIRNase-free DNasel將得到的RNA去除DNA污染后再進行cDNA的合成。用Takara的M-MLV反轉錄試劑盒進 行cDNA的合成，25-yL反應體系中包含2yg RNA。在42°C條件下經過60min的反轉錄反應后將 反轉錄產物置于冰上放置5min，之后將反轉錄產物于-20°C低溫冰箱中保存備用。
[0007] (3)基因克隆 通過RT-PCR進行克隆，PCR擴增所用的聚合酶為LA Taq? DNA polymerase(TaKaRa)， 在25-yL體系中加入以下成分：2.5yL 10XPCR buffer(含MgCl2);2.5yL 10mM dNTPs;lyL cDNA模板；0.5yL LA polymerase和 17.5yL ddifeOc^PCR反應條件為：（a)94°C，5min;(b)94 °<3,458;54°(3,608;72°(3,908 ;共35〇7(3168;((3)72°(3，101^11。擴增基因全長所用引物為 AhbHLHIL-S:5 '-ACTGAATGCTCCTGTGCCC-3 ' 和AhbHLHIL-A:5 '-GCTCCTGCCCTTTGCTATCT-3 '。 PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Omega)進行純化，純化產物連接 pMD18_T Easy vector(Takara)并測序（Sangon,Shanghai)。
[0008] 本發明的AhbHLHIL基因開放閱讀框為1260bp，共編碼420個氨基酸。
[0009] 本發明的AhbHLHIL基因的氨基酸序列在NCBI網站上通過Blast分析后發現該基因 氨基酸序列上有DNA結合位點，蛋白二聚體互作區及HLH保守結構域，同時該基因編碼的氨 基酸序列與大豆bHLH130-like同源性近60%。
[0010]本發明的AhbHLHIL基因的核苷酸序列是序列表中序列1。
[0011] 本發明的AhbHLHIL基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
[0012] ⑷表達分析 用熒光定量Real-time RT-PCR對AhbHLHIL基因進行表達分析。熒光定量PCR所用cDNA 模板稀釋到8ngyL-S用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase(Takara)，用的儀器是 LightCycler 2 · Oinstrument system(Roche，Germany)，每反應體系加2yL稀釋的cDNAqPCR 反應程序如下：（1)95°<3，108;(2)95°(3,58,4(^7(3168;(3)60°(3,308 ;(4)72°(3，108。？〇?反應 結束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加 O.Stdctinll為實驗的內參基因。
[0013] AhbHLHIL熒光定量驗證用的引物序列為：QAhbHLHIL-S: 5'-GAGTGTTATGTATA GTCCTGTTC-3 ' 和QAhbHLHIL-A:5 '-TGTTGTTGTTGATGATGATGA-3 '。
[0014] 內參基因&(：衍1111所用引物序列為：〇厶(：1'11-5 :5'-1766厶厶了6661^6厶厶66厶了6(：-3'和 QACT11-A:5 '-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3 '。
[0015]本發明的顯著效果 通過熒光定量PCR驗證了 AhbHLHIL在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達模式，結果表明 該基因在三種非生物逆境脅迫下轉錄水平均有明顯升高（圖1)。從圖1可以看出，AhbHLHIL 在低溫、鹽和干旱處理的根中表達量均有明顯提高，并且此后一直維持在高于對照的水平 (圖1A，C，E)，在鹽處理的葉片中表達量也明顯增高（圖1D)。以上結果表明AhbHLHIL可能在 花生對逆境脅迫的適應性中發揮重要作用。將該基因通過轉基因手段導入擬南芥中，轉基 因植株比對照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。說明AhbHLHIL基因能顯著提高植物的抗 逆性。
【附圖說明】
[0016] 圖1 AhbHLHIL基因在花生根(A，C，E)和葉片(B，D，F)中受NaCl(A，B)、低溫(C，D)和 PEG6000 (E，F)脅迫處理不同時間表達變化分析。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖與具體實施例進一步說明本發明，但并不是對本發明的進一步限 定。
[0018] 本發明的具體實施過程為： 1實驗材料與方法 1.1實驗材料 實驗材料為花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生種子在營養 土和蛭石以2:1混合的土中萌發，萌發后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗（28°C/22°C)。生 長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續的非生物脅迫處理實驗。
[0019] 對于低溫處理，將三葉期花生幼苗至于4°C光照培養箱中進行處理，分別于處理的 Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生葉片和根作為實驗材料;對于耐鹽用NaCL處理;對 于抗旱，用PEG6000處理。將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生 根分別浸泡在200mM NaCl或20 %PEG6000溶液中，在處理的Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和 72h分別取花生的葉片和根作為實驗材料。所有材料均保存于-80°C超低溫冰箱中備用。
[0020] 1.2 RNA的提取和cDNA的合成 本實驗用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分離提取花生幼苗RNAeRQIRNase-free DNasel將得到的RNA去除DNA污染后再進行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega，Madison，WI，USA)進行cDNA的合成，25-yL反應體系中包含2yg RNA。在42°C條件 下經過60min的反轉錄反應后將反轉錄產物置于冰上放置5min，之后將反轉錄產物于-20°C 低溫冰箱中保存備用。
[0021] 1.3基因克隆 通過RT-PCR進行克隆，PCR擴增所用的聚合酶為LA