一種用于單細胞全基因組擴增的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于單細胞全基因組擴增的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著流式細胞儀和激光顯微切割技術的應用發展，分離單個目標細胞成為一件相 對容易的事情。單細胞具有該物種的全部基因組信息，與獲自多細胞的基因組樣本相比， 獲自單細胞的基因組樣本沒有細胞異質性等缺陷，因此單細胞具有重要的遺傳分析應用價 值。隨著第二代高通量測序技術的成熟與推廣應用，基于基因測序的遺傳學分析也隨之發 展起來，然而大多數遺傳分析最基本的要求是具有足夠數量的高質量基因組DNA，為了使單 細胞能夠滿足遺傳分析的需求，如何從單細胞樣本中獲得足夠多的高質量基因組DNA就成 了一個關鍵技術。
[0003] 全基因組擴增技術（Whole Genome Amplification，WGA)是一種從有限DNA或者單 個細胞中產生足量DNA的體外擴增方法。當前，主要有兩種不同的策略來實現WGA，分別是 基于PCR的擴增策略和基于Phi29DNA聚合酶的恒溫擴增策略。其中最具代表性的方法包 括簡并寡核苷酸引物 PCR(Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR，D0P_PCR)和多重置 換擴增（Multiple Displacement Amplification, MDA)。越來越多的研究發現，以 D0P-PCR 為代表的基于PCR的WGA，會出現覆蓋率低、雜合子丟失，不能在單個核苷酸的分辨率上評 價單個細胞的遺傳學特征等缺陷，這些都極大限制了該技術的應用范圍。相較于D0P-PCR， MDA是目前公認為最好的WGA。MDA利用隨機引物與模板DNA在多個位點退火結合，隨后 Phi29DNA聚合酶在多個退火結合位點處同時起始復制，Phi29DNA聚合酶沿著模板合成新 的DNA，同時取代模板的互補鏈，被置換的互補鏈又成為新的模板，被隨機引物結合后進行 擴增。基于Phi29DNA聚合酶的MDA具有以下優點：（1)不需要經過高溫變性，用相對較溫 和的堿性裂解法使DNA釋放，能減少模板的降解；（2) Phi29DNA聚合酶對模板有很強的結合 能力，同時具有3' 一 5'外切酶活性，可以保證DNA復制的高保真性；（3)Phi29DNA聚合酶 具有很強的連續合成能力，擴增產量高，可以滿足所有下游的核酸分析要求。
[0004] 目前，市場上的MDA試劑盒以QIAGEN公司生產的REPLI-g系列產品為主，其高效 穩定的擴增效果擁有很高的評價。但是，伴隨而來的高擴增成本，也成為制約其產業化道路 的重要因素。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種用于單細胞全基因組擴增的試劑盒及其應用。
[0006] 本發明首先保護一種用于單細胞基因組擴增的試劑盒，包括擴增體系乙；
[0007] 所述擴增體系乙由10父？1^29131^€6廣水和擴增體系甲組成；
[0008] 單份擴增體系甲由（1. 8-2. 2) X 10 smol dNTP、引物總濃度為（1. 8-2. 2) X 10 nmol N8primers、（4. 5-5. 5)X10 3mg BSA、0. 0045-0. 0055 μ 1 Pluronic F68 和 9-11U Phi29DNA 聚合酶組成；所述NSprimers為隨機引物，由8個脫氧核糖核苷酸組成，A、G、C和T隨機排 列。
[0009] 所述單份擴增體系甲具體可由2X 10 8mol dNTP、2X 10 nmol所述N8primers、 5X103mg BSA、0.005yl Pluronic F68 和 10U Phi29DNA 聚合酶組成。
[0010] 本發明還保護另一種用于單細胞基因組擴增的試劑盒，包括擴增體系乙；
[0011] 單份擴增體系乙為 40. 3μ 1，由 30μ 1 Η20、5μ 1 10XPhi29buffer、2y 1 dNTP 溶 液、2 μ 1 N8primers 溶液、0· 25 μ 1 20mg/ml 的 BSA 水溶液、0· 05 μ 1 10% Pluronic F68 溶 液和1 μ 1 Phi29DNA聚合酶溶液組成；
[0012] 所述 dNTP 溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的濃度均為 10mM ;所述 N8primers 溶液 中，引物總濃度為1〇μΜ;所述10%Pluronic F68溶液中，10%代表體積比；所述Phi29DNA 聚合酶溶液中Phi29DNA聚合酶的濃度為lOU/μ 1 ;
[0013] 所述NSprimers為隨機引物，由8個脫氧核糖核苷酸組成，A、G、C和T隨機排列。
[0014] 以上任一所述試劑盒還可包括細胞變性裂解液和中和緩沖液；
[0015] 所述細胞變性裂解液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度如下： 0· 09-0. llmM Κ0Η、0· 9-1. ImM EDTA 和 0· 09-0. 11M DTT ;
[0016] 所述中和緩沖液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度如下：54-66mM ΚΗ 2Ρ04 和 4. 5-5. 5mM Κ2ΗΡ04〇
[0017] 所述細胞變性裂解液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度具體如下： 0·ImM Κ0Η、ImM EDTA 和 0· 1M DTT ;
[0018] 所述中和緩沖液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度具體如下：60mM ΚΗ2Ρ0 4 和 5mM Κ2ΗΡ04。
[0019] 本發明還保護一種單細胞基因組擴增的方法，包括如下步驟：
[0020] (1)取單個細胞，進行細胞裂解，得到模板溶液；
[0021] (2)將步驟⑴得到的全部模板溶液與擴增體系乙混合，得到初始反應體系，然后 進行反應，得到擴增產物；
[0022] 所述擴增體系乙由10父？1^29131^€6廣水和擴增體系甲組成；
[0023] 所述擴增體系甲由 dNTP、N8primers、BSA、Pluronic F68 和 Phi29DNA 聚合酶組成； 所述NSprimers為隨機引物，由8個脫氧核糖核苷酸組成，A、G、C和T隨機排列；
[0024] 所述初始反應體系中，溶劑為lXPhi29buffer ;
[0025] 所述擴增體系甲中的各個組分在所述初始反應體系中的濃度如下：0. 36-0. 44mM dNTP、引物總濃度為 0· 36-0. 44μΜ 的 N8primers、0. 09-0. llmg/ml BSA、0. 009% -0· 011% 體積比的 Pluronic F68 和 0· 18-0. 22υ/μ 1 Phi29DNA 聚合酶。
[0026] 所述擴增體系甲中的各個組分在所述初始反應體系中的濃度具體如下：0.4mM dNTP、引物總濃度為 0· 4 μ Μ 的所述 N8primers、0. lmg/ml BSA、0. 01 % 體積比的 Pluronic F68 和 0· 2U/ μ 1 Phi29DNA 聚合酶。
[0027] 所述步驟（1)中，采用細胞變性裂解液進行所述細胞裂解，采用中和緩沖液終止 所述細胞裂解；
[0028] 所述細胞變性裂解液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度如下： 0· 09-0. 1ImM Κ0Η、0· 9-1. ImM EDTA 和 0· 09-0. 11M DTT ;
[0029] 所述中和緩沖液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度如下：54-66mM ΚΗ2Ρ04 和 4· 5-5. 5mM Κ2ΗΡ04〇
[0030] 所述細胞變性裂解液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度具體如下： 0·ImM KOH、ImM EDTA 和 0· 1M DTT ;
[0031] 所述中和緩沖液由溶質和溶劑組成；溶劑為水；溶質及其濃度具體如下：60mM ΚΗ2Ρ0 4 和 5mM Κ2ΗΡ04。
[0032] 所述步驟（2)中，所述反應的條件為：30°C靜置3h，隨后65°C靜置5分鐘。
[0033] 本發明還保護另一種單細胞基因組擴增的方法，包括如下步驟：
[0034] (1)取單個細胞，加入3. 7 μ 1 PBS緩沖液和3 μ 1細胞變性裂解液，65°C靜置10分 鐘，然后加入3 μ 1中和緩沖液，得到9. 7 μ 1模板溶液；
[0035] (2)取步驟（1)得到的9. 7 μ 1模板溶液，加入單份擴增體系乙，30°C靜置3h，隨后 65 °C靜置5分鐘，得到擴增產物；
[0036] 單份擴增體系乙為 40. 3 μ 1，由 30 μ 1 Η20、5 μ 1 10XPhi29buffer、2 μ 1 dNTP 溶 液、2 μ 1 N8primers 溶液、0· 25 μ 1 20mg/ml 的 BSA 水溶液、0· 05 μ 1 10% Pluronic F68 溶 液和1 μ 1 Phi29DNA聚合酶溶液組成；
[0037] 所述 dNTP 溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的濃度均為 10mM ;所述 N8primers 溶液 中，引物總濃度為1〇μΜ;所述10%Pluronic F68溶液中，10%代表體積比；所述Phi29DNA 聚合酶溶液中Phi29DNA聚合酶的濃度為lOU/μ 1 ;
[0038] 所述NSprimers為隨機引物，由8個脫氧核糖核苷酸組成，A、G、C和T隨機排列。
[0039] 所述PBS緩沖液具體可為ρΗ7· 5、0· 1M的PBS緩沖液。
[0040] 所述細胞變性裂解液由溶質和