一種高效、可循環生物催化劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效、可循環生物催化劑的制備方法，屬于生物催化劑的制備技術。
【背景技術】
[0002]生物催化由于具有溫和、高效和高選擇性等特點，在大宗化學品和精細化學品的工藝取代等方面發揮日益重要的作用。盡管生物催化劑(酶、細胞)具有上述優勢，但是難以循環且容易失活，限制了生物催化的廣泛應用。雜化微囊由于具有獨特的核殼結構、雜化囊壁、高的比表面積和較短的傳質距離，已廣泛用于生物催化劑的構建。其中空心內核可用于包埋酶分子，雜化囊壁可以實現物質的交換。通過調控囊壁中有機、無機組分，可得到適宜的微環境和良好的機械性能。因此，利用雜化微囊構建的生物催化劑表現出了良好的活性和穩定性。然而，雜化微囊的循環需要借助離心或過濾等操作，限制了雜化微囊的大規模應用。此外，循環或過濾過程易造成微囊的破損，影響了其循環穩定性。開發一種高效、可循環生物催化劑的制備方法具有重要價值和迫切需求。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種高效、可循環生物催化劑的制備方法。本發明制備原料廉價、易得，制備工藝簡單易行。
[0004]本發明提出的一種高效、可循環生物催化劑的制備方法，包括以下步驟:
[0005]步驟一、向濃度為0.2?0.4M的碳酸鈉溶液中加入聚苯乙烯磺酸鈉，配成聚苯乙烯磺酸鈉濃度為1?3mg/mL的溶液A;配制和碳酸鈉溶液等摩爾濃度的氯化鈣溶液，向氯化鈣溶液中加入葡萄糖氧化酶，配成葡萄糖氧化酶濃度為0.5?lmg/mL的溶液B;在800?1200r/min轉速下，將溶液A迅速倒入等體積的溶液B中，反應25?30s，靜置8?lOmin，在3000r/min的轉速下離心分離，去除上清液后用去離子水洗滌，重復離心-水洗，至上清液不含聚苯乙烯磺酸鈉和葡萄糖氧化酶，得到包埋了葡萄糖氧化酶的碳酸鈣微球；
[0006]步驟二、向水中加入一定質量的瓊脂糖，加熱溶解后，配成瓊脂糖濃度為1%?3 %w/v的溶液C;將步驟一制得的葡萄糖氧化酶的碳酸鈣微球加入溶液C中，混合均勻，自然冷卻，得到分散有葡萄糖氧化酶的碳酸鈣微球的瓊脂糖凝膠；
[0007]步驟三、配制濃度為l-3mg/mL的精蛋白溶液;配制濃度為0.01?0.03M的硅酸鈉溶液，調節硅酸鈉溶液的pH為7.0?8.0;
[0008]步驟四、先將步驟二制得的瓊脂糖凝膠浸泡到精蛋白溶液中5-15min，隨后取出再浸泡到去離子水中清洗;然后，將清洗后的瓊脂糖凝膠浸泡到硅酸鈉溶液中5-15min，隨后取出再浸泡到水中清洗;執行步驟四1?2次；
[0009]步驟五、配制乙二胺四乙酸二鈉濃度為0.03?0.05M的溶液D，調節溶液D的pH為5.0?6.0;將步驟四得到的瓊脂糖凝膠浸泡到溶液D中，每15min換一次溶液D，至完全去除碳酸鈣微球為止;隨后將瓊脂糖凝膠浸泡到去離子水中清洗，至上清液不含乙二胺四乙酸二鈉，所得膠體即為高效、可循環生物催化劑。
[0010]與現有技術相比，本發明所具有的有益效果是:
[0011]本發明制備方法首先是利用共沉淀法制備了包埋有葡萄糖氧化酶的碳酸鈣微球，隨后利用溶膠-凝膠法將碳酸鈣微球分散到瓊脂糖凝膠中。在碳酸鈣微球表面實施仿生礦化，形成了精蛋白-氧化硅雜化囊壁。隨后將上述凝膠浸泡到乙二胺四乙酸二鈉溶液中去除碳酸鈣微球，得到分散有精蛋白-氧化硅雜化微囊的瓊脂糖凝膠，并將葡萄糖氧化酶包埋到了雜化微囊囊腔中。上述膠體用作催化劑時表現出了良好的活性和循環穩定性，可用鑷子實現簡單回收。本發明制備原料廉價、易得，制備條件溫和，制備工藝簡單易行，通過控制制備過程中仿生礦化步驟的次數，可實現生物催化劑性能的調控。
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1制備的膠體用作催化劑時溶液吸光度隨時間的變化曲線；
[0013]圖2為實施例1制備的膠體用作催化劑時的循環穩定性；
[0014]圖3為實施例2制備的膠體用作催化劑時溶液吸光度隨時間的變化曲線；
[0015]圖4為實施例2制備的膠體用作催化劑時的循環穩定性；
[0016]圖5為對比例1制備的微囊用作催化劑時溶液吸光度隨時間的變化曲線；
[0017]圖6為對比例1制備的微囊用作催化劑時的循環穩定性；
[0018]圖7為對比例2制備的微囊用作催化劑時溶液吸光度隨時間的變化曲線；
[0019]圖8為對比例2制備的微囊用作催化劑時的循環穩定性。
【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖和具體實施例對本發明技術方案作進一步詳細描述，所描述的具體實施例僅對本發明進行解釋說明，并不用以限制本發明。
[0021]實施例1
[0022]步驟一、向濃度為0.3M的碳酸鈉溶液中加入聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)，配成PSS濃度為3mg/mL的溶液A ；配制和碳酸鈉溶液等摩爾濃度的氯化鈣溶液，向氯化鈣溶液中加入葡萄糖氧化酶(G0D)，配成G0D濃度為lmg/mL的溶液B;在800r/min轉速下，將溶液A迅速倒入等體積的溶液B中，反應30s，靜置lOmin，在3000r/min的轉速下離心分離，去除上清液后用去離子水洗滌，重復離心-水洗，至上清液不含PSS和G0D，得到包埋了 G0D的碳酸鈣微球(G0D-encapsulated CaC03微球)；
[0023]步驟二、向水中加入一定質量的瓊脂糖，加熱溶解后，配成瓊脂糖濃度為l%w/v的溶液C;將GOD-encapsulated CaC03微球加入溶液C中，混合均勻，自然冷卻，得到分散有GOD-encapsulated CaC03微球的瓊脂糖凝膠D;
[0024]步驟三、配制濃度為3mg/mL的精蛋白溶液;配制濃度為0.03M的硅酸鈉溶液，調節溶液的pH為7.0;
[0025]步驟四、將凝膠D浸泡到精蛋白溶液中15min，隨后將凝膠D浸泡到去離子水中清洗;將凝膠D浸泡到硅酸鈉溶液中15min，隨后將凝膠D浸泡到水中清洗；
[0026]步驟五、配制乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)濃度為0.05M的溶液E，調節溶液E的pH為6.0;將步驟四得到的凝膠D浸泡到溶液E中，每15min換一次溶液E，至完全去除碳酸鈣微球為止;隨后將凝膠浸泡到去離子水中清洗，至上清液不含m)TA;
[0027]步驟六、配制濃度為0.05M的磷酸鹽緩沖液，調節溶液的pH為7.0 ;配制濃度為0.005M的葡萄溶液;配制濃度為0.1M的醋酸鹽緩沖液，調節溶液的pH為5.0 ;配制濃度為0.004M的3，3"，5，5"-四甲基聯苯胺(TMB)溶液;配制濃度為lmg/mL的辣根過氧化物酶(HRP)的溶液;取0.5mL的葡萄溶液加入4.5mL的磷酸鹽緩沖液中，配制溶液F;取0.10mL的TMB溶液和0.05mL的HRP溶液加入0.83mL的磷酸鹽緩沖液中，配制溶液G;
[0028]步驟七、將步驟五制備的膠塊加入到溶液F中；每隔30min，