固定化脂酶及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及固定化脂酶及其制備方法，特別涉及固定化脂肪酶的制備方法。本發 明還涉及制備的固定化脂肪酶在生產生物柴油中的應用。
【背景技術】
[0002] 脂肪酶是一類特殊的酰基水解酶，能夠在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交 換、及立體異構體拆分等化學反應，常被應用于食品、日化、生物能源等領域。然而，它的廣 泛應用仍然被穩定性差、易失活、不能重復使用，并且反應后混入產品，給分離純化帶來困 難等缺陷所限制。為了改善脂肪酶的這些特性，開發了許多利用載體固定化脂肪酶的技術， 主要包括物理吸附，共價交聯和有機/無機材料包裹三種方式。
[0003] 物理吸附方法的代表是目前諾維信公司（Novozymes)商品化的固定化脂肪酶 (Novozym 435)，是用大孔樹脂吸附的脂肪酶。此外還有用活性炭、硅膠等材料進行吸附的 方法。其次，共價交聯法多采用高碘酸鈉、戊二醛等化學試劑將酶與載體進行交聯。包裹方 式的脂肪酶固定化方法主要采用聚丙烯酸酯、聚氨酯、有機硅等作為粘合劑與粗酶粉或酶 溶液混合成漿狀涂布于載體上。然而，吸附法存在溫度穩定性較差、反應擴散阻力較大、吸 附不牢固等問題。共價法和包埋法，需要借助多種化學試劑，共價法甚至涉及多步化學反 應，會導致脂肪酶部分位點的失活，造成脂肪酶活力的下降。而且，上述傳統方法得到的固 定化酶是脂肪酶粗酶制劑，含有多種雜蛋白，不具有專一性；此外酶與產物分離仍然需要高 速離心的方式，費時耗力，不具有便捷性。
【發明內容】
[0004] 第一方面，本申請提供了一種固定化脂酶，其包括脂酶和作為固定載體的磁性顆 粒。
[0005] 在本發明的一些實施方案中，所述脂酶攜帶分子標簽，所述磁性顆粒的表面包含 能夠與所述分子標簽結合的物質。在優選的實施方案中，所述脂酶所攜帶的分子標簽為組 氨酸標簽（His-tag)。
[0006] 在一些實施方案中，與上述分子標簽結合的物質為金屬離子，在優選的實施方案 中，所述金屬離子為鈷、鎳、銅、鋅、鐵等。更優選地，所述金屬離子為Co 2+。
[0007] 在一些實施方案中，本發明所用的磁性顆粒的直徑為0. 1-10 μ m，優選為約 1-5 μ m。在一實施方案中，所述磁性顆粒的磁核選自鐵氧體、金屬、金屬合金、鐵氧化物、二 氧化鉻等。在優選的實施方案中，所述磁核為鐵氧化物，更優選為YFe304。
[0008] 在優選的實施方案中，固定化脂酶的固定作用力是基于磁珠表面的金屬離子（例 如Co2+)與脂酶上分子標簽（例如His-tag)之間的螯合親和作用。這種固定方式能方便快 捷地利用磁分離回收酶（便捷性），且結合力（親和作用）比普通物理吸附法更為牢固（高 穩定性）。
[0009] 在優選的實施方案中，上述脂酶為脂肪酶或磷脂酶，更優選為微生物脂肪酶。在 一些實施方案中，上述微生物脂肪酶為來自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)、疏棉狀嗜熱絲抱菌（Thermomyces lanuginosus)、南極假絲酵母（Candida antarctic)、黑曲霉菌（Aspergillus niger)、裙皺假絲酵母（Candida rugosa)、假單胞菌 屬（Pseudononas sp.)等。在一優選的實施方案中，本發明所述的脂肪酶為米黑根毛霉脂 肪酉每（Rhizomucor miehei lipase, RML)〇
[0010] 本發明的固定化脂酶具有下述至少一種特性：更好的熱穩定性、更高的有機溶劑 耐受性，更優異的儲藏穩定性和可重復利用性，有利于酶法生物加工在工業化中的應用，例 如大量制備生物柴油。
[0011] 第二方面，本申請提供了固定化脂酶的制備方法，其包括將攜帶分子標簽的脂酶 與磁性顆粒接觸，從而得到固定于所述磁性顆粒上的脂酶，其中所述磁性顆粒的表面包含 能夠與所述分子標簽結合的物質。
[0012] 本發明通過金屬離子（如Co2+)修飾的磁性顆粒借助His-tag和Co 2+之間的螯合 作用，一步法特異純化并固定化脂酶。這種方式既實現了固定化酶的高純度（專一性），又 能方便快捷地利用磁分離回收酶（便捷性），且結合力（親和作用）比普通物理吸附法更為 牢固（高穩定性）。
[0013] 在本發明的一些實施方案中，將脂酶與磁性顆粒接觸10-30分鐘，優選為約20分 鐘。在一些實施方案中，上述脂酶與磁性顆粒的比例為l-5mg脂酶/mg磁性顆粒。在優選 的實施方案中，所述脂酶與磁性顆粒在pH為7-10、更優選為約8的條件下進行接觸。
[0014] 在一些實施方案中，本申請所用的脂酶溶液為細胞裂解得到的粗酶溶液。在優 選的實施方案中，上述脂酶為脂肪酶或磷脂酶，更優選為微生物脂肪酶。在一些實施方案 中，上述微生物脂肪酶為來自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)、疏 棉狀嗜熱絲抱菌（Thermomyces lanuginosus)、南極假絲酵母（Candida antarctic)、黑曲 霉菌（Aspergillus niger)、裙皺假絲酵母（Candida rugosa)、假單胞菌屬（Pseudononas sp.)等。在一優選的實施方案中，本發明所述的脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase, RML)〇
[0015] 本發明人將分子標簽引入脂酶，利用磁性顆粒一步法完成了脂酶的純化和固定 化。此外，固定化后的酶還具有下述至少一種特性：更好的熱穩定性、更高的有機溶劑耐受 性，更優異的儲藏穩定性和可重復利用性，有利于酶法生物加工在工業化中的應用，例如大 量制備生物柴油。
[0016] 第三方面，本申請還提供了由上述方法制備的固定化脂酶，其中所述脂酶攜帶分 子標簽，所述磁性顆粒的表面包含能夠與所述分子標簽結合的物質。優選地，所述固定化脂 酶為固定于磁性顆粒的脂肪酶。
[0017] 在優選的實施方案中，不僅本申請的固定化酶能重復利用，連所用的基材（磁性 顆粒）本身都能重復利用。
[0018] 第四方面，本申請提供了本發明的固定化脂酶在生產生物柴油中的應用。
[0019] 本申請的固定化酶具有更優異的有機溶劑（甲醇）耐受性，利于脂肪酶在生物柴 油（高級脂肪酸與甲醇酯化后的產物）制備中的應用。
[0020] 第五方面，本申請提供了磁性顆粒的用途。
[0021] 具體地，提供了磁性顆粒在制備固定化脂酶中的用途，所述磁性顆粒用于純化和 固定化脂肪酶。在優選的實施方案中，所述脂酶攜帶分子標簽，所述磁性顆粒的表面包含能 夠與所述分子標簽結合的物質。
[0022] 另外，本申請還提供了磁性顆粒在回收固定化脂酶中的用途，其中所述磁性顆粒 作為固定化脂酶的載體，提供磁響應性，便于固定化脂酶的回收和重新利用。
[0023] 附圖簡要說明
[0024] 圖1顯示了固定化脂肪酶RML經洗滌和洗脫后的樣品的凝膠電泳圖，其中從左到 右，各泳道加載的樣品分別為泳道1 :菌體破碎離心后的上清液（即粗酶液）；泳道2 :粗酶 液與磁珠孵育后的上清液；泳道3-5 :洗滌孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-5分別對應 第1、2、3次洗滌得到的上清液；泳道6 :第一次洗脫得到的洗脫液樣品，泳道7為：第二次洗 脫得到的洗脫液樣品。
[0025] 圖2顯示了固定化RML在不同溫度下的相對酶活力，以檢測其與游離RML相比的 最適溫度（圖2A)和熱穩定性（圖2B)。
[0026] 圖3顯示了固定化RML和游離RML在不同濃度甲醇存在下的剩余酶活力，其中橫 坐標為甲醇濃度，縱坐標為剩余酶活力。
[0027] 圖4顯示了固定化RML和游離RML在儲存不同時間后剩余的酶活力。
[0028] 圖5顯不了固定化RML的磁響應性。A圖顯不未置于磁場的固定化RML懸浮液的 分布狀態，B圖是固定化RML懸浮液置于磁場后的分布狀態。
[0029] 圖6顯示了（ Λ )回收的固定化RML的酶活力，以及（□)由重生磁珠重新吸附 RML后得到的固定化RML的酶活力，其中縱坐標為相對剩余酶活力，橫坐標為重復利用次 數。
[0030] 圖7顯示不同尺寸的磁性顆粒的磁響應性，左側樣品的磁性顆粒直徑為1 μ m，右 側樣品的磁性顆粒直徑為l〇nm。
[0031] 圖8A顯示了固定化磷脂酶PLC(CL0PLC8(GenBank:D49969. 1)經洗滌和洗脫后的 樣品的凝膠電泳圖，其中從左到右，各泳道加載的樣品分別為泳道1 :菌體破碎離心后的上 清液（即粗酶液）；泳道2 :粗酶液與磁珠孵育后的上清液；泳道3-6 :洗滌孵育后的磁珠得 到的上清液，泳道3-6分別對應第1、2、3、4次洗滌得到的上清液；泳道7 :洗