一種有機磷農藥降解菌劑及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，涉及一株用于降解有機磷農藥的微生物，具體涉及一株分離自辣椒葉際的地衣芽孢桿菌，及其菌劑的制備方法和高效降解有機磷類農藥中的應用。
【背景技術】
[0002]有機磷農藥以其品種多、藥效高、防治范圍廣譜等特點，至今仍是農藥中用量最多的類別，在農業生產中起到了舉足輕重的作用，我國有機磷農藥的生產和使用量占農藥總生產和使用量的一半以上。但是，有機磷農藥具有較強的毒性，長期、大量使用后，其在農作物上的殘留會引起食品安全問題，也影響了我國農產品出口，而且散落的農藥也會使水和土壤受到污染。
[0003]利用微生物降解有機磷農藥殘留的生物修復方法具有低成本、無毒、無二次污染等優點，是最具應用前景的削減農藥污染的方法之一。有機磷農藥降解微生物篩選常用的方法是從長期遭受農藥污染的土壤或水體中采集樣品，經富集培養、平板劃線等操作，分離得到單菌落，然后經馴化培養，或紫外化學誘變等方法獲取高效降解菌株，或通過細胞工程、基因工程等技術手段構建工程菌株。例如:中國發明專利(申請號:200610090054.7)公開了一株降解有機磷農藥的施氏假單胞菌，是從農藥廠排污口土壤樣品中分離的；中國發明專利(申請號:200410081019.X)公開了一株降解有機磷農藥的蒼白桿菌，是從長期農藥污染的土壤中分離獲得。
[0004]植物的葉際是指植物的地上部分，包括葉、莖、花、果等的表面或內部的小環境。在植物的葉際范圍內生活著多種微生物，主要有細菌、真菌、放線菌等，這些在葉際生存的微生物稱為葉際微生物。對于葉際微生物而言，植物葉際環境相當惡劣，在強烈的日照下，其表面干燥，溫度可以達到50°C，紫外線強烈，而夜晚溫度又驟降，還有刮風、下雨等天氣變化等。對于分離自土壤、污泥等來源的農藥降解微生物，不一定能適應植物葉際的惡劣環境，其降解效率往往會受到顯著影響。而從植物的葉際分離的農藥降解微生物能夠在葉際長期生存，比較適應多變的葉際環境，更適合原位降解作物表面的農藥殘留。
[0005]目前尚未發現使用從辣椒葉際分離出的地衣芽孢桿菌制成降解有機磷農藥的菌劑的報道。
【發明內容】
[0006]為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一有機磷農藥降解菌劑，該有機磷農藥降解菌劑能夠高效降解有機磷農藥。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種有機磷農藥降解菌劑的制備方法。
[0008]為了實現上述目的，本發明提供一種有機磷農藥降解菌劑，包含質量分數為95-98.5%的濃度為101()CFU/mL的地衣芽孢桿菌，質量分數為0.5-1 %的甘氨酸，質量分數為
0.5-2%的甘油和質量分數為0.5-2%的吐溫80;其中，該地衣芽孢桿菌的菌種分類名稱為:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B4，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期:2012年10月15日，保藏編號:CGMCC N0.6677。
[0009]本發明還提供一種所述的有機磷農藥降解菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0010]步驟1.培養基配制:
[0011]1)菌種保藏培養基:蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加蒸餾水至1L，調pH7.0-7.8,115°C 滅菌 20-30min，每 100mL 倒一塊平板；
[0012]2)菌種活化培養基:蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加蒸饋水至1L，調pH7.0-7.8，115°C 滅菌 20-30min;
[0013]3)種子培養基:]\%5041.(^，腿2?045.(^，恥(:1 5.0g，K2HP04l5.0g，糖蜜 200g，酵母膏50g，加蒸餾水至 10L ,pH7.0-7.8,115°C 滅菌 20_30min ；
[0014]4)發酵培養基:MgS0420g，KH2PO4100g，NaCl 1 OOg，K2HP04300g，(NH4)2SO40.5kg，糖蜜 10kg，豆餅粉 2kg，加水至 200L，pH7.0-7.8，115°C 滅菌 20_30min ；
[0015]步驟2.菌種活化:挑取權利要求1所述的地衣芽孢桿菌，接種至菌種保藏培養基平板，30°C連續劃線、挑單菌落培養兩次，然后，挑取單菌落接種于菌種活化培養基中，30°C，150-200r/min 搖床振蕩培養 12-20h ；
[0016]步驟3.液體種子制備:向裝有經高溫滅菌的種子培養基的發酵罐中，按照3-8%的接種量接種步驟2活化的地衣芽孢桿菌，32-37°C，通空氣培養15-20h，得到液體種子；
[0017]步驟4.液態發酵:向裝有高溫滅菌的發酵培養基的發酵罐中，按照3-8%的接種量接種步驟3制備的液體種子，32-37°C，通空氣培養15-20h，得到活菌體培養物；
[0018]步驟5.菌劑制備:培養好的發酵液經細菌計數后，超濾濃縮，調節至101()CFU/mL，加入質量分數為0.5-1%的甘氨酸、質量分數為0.5-2%的甘油和質量分數為0.5-2%的吐溫80，灌裝，保藏于陰涼處。
[0019]該有機磷農藥降解菌劑使用時用水稀釋300-600倍，噴灑在植物表面即可。
[0020]該可降解有機磷農藥的地衣芽孢桿菌菌株是由中國科學院環境生物技術重點實驗室從辣椒的葉面上分離篩選獲得。該地衣芽孢桿菌屬于葉際微生物，能夠很好適應葉際的惡劣條件，可以保持良好的有機磷降解效果。
[0021]本發明的有益效果在于:
[0022]本發明提供一種有機磷農藥降解菌劑及其制備方法，其中的地衣芽孢桿菌提取自辣椒的葉際環境，能夠降解有機磷農藥，尤其可原位降解農作物表面殘留的有機磷農藥，對于敵敵畏的降解效率可達到85 %左右，對于樂果的降解效率可達到75 %左右，從而降低有機磷農藥對食用植物葉、果實的人畜的毒性，提高了食品的安全性，同時其屬于存在于辣椒的葉際環境的葉際微生物，對環境沒有危害。
【具體實施方式】
[0023]以下通過具體實施例詳細說明本發明的實施，目的在于更好地理解本發明的精神實質，但不作為對本發明實施范圍的限定。
[0024]本發明的有機磷農藥降解菌劑中使用的地衣芽孢桿菌，其菌種分類名稱為:地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B4，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期:2012年10月15日，保藏編號:CGMCC N0.6677。該菌種由中國科學院環境生物技術重點實驗室白教授惠贈。
[0025]實施例1:有機磷農藥降解菌劑的制備