酵母融合菌混菌劑及其液體菌劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明主要涉及微生物的菌劑的制備方法，尤其涉及利用輕工食品行業產生的廢 水發酵制備酵母融合菌、地衣芽孢桿菌、圓褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳桿菌五菌組合的液體 菌劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國每年約有20億立方的高濃度有機廢水排放，占全國工業廢水排放量的6%，因 為這些高濃度有機廢水分布廣泛而水量又大，特別在西北甘肅定西市是盛產馬鈴薯的地 區，馬鈴薯淀粉加工企業約有30余家，每年約有500余萬立方的高濃有機淀粉廢水在排放， 這些馬鈴薯淀粉廢水中含有高濃度的有機物(⑶!^在 100001118凡以上），這些高濃度廢水在 夏、秋天極易滋生蚊蠅，產生惡臭氣體對當地的生態環境造成嚴重污染和影響，雖然這些馬 鈴薯淀粉加工企業也在多方尋找治污措施，但由于存在治污設備投資大，廢水處理成本高， 處理效果不理想等原因，所以治污難題已嚴重影響這些企業的正常生產。馬鈴薯的生產是 定西市干旱地區的支柱產業，深加工制做馬鈴薯淀粉也是這些地區脫貧致富的主要手段。 其實這些馬鈴薯淀粉有機廢水中含有豐富的可溶性有機物如蛋白質、氨基酸、有機酸、淀 粉、糖分、有機鹽和維生素等，這些營養物質卻是發酵培養有益微生物的好原料，一方面我 們利用這些馬鈴薯淀粉有機廢水培養和制備了有益微生物液體混菌劑產品，該菌劑產品能 廣泛用于農業種植、禽畜養殖、有機生物堆肥發酵接種劑、改良土壤和環境治理等方面，并 已取得了較好的作用和效果；另一方面也解決了這些馬鈴薯淀粉食品加工企業的治污難 題，是一舉多得生物技術。
[0003] 傳統的微生物液體菌劑的制備方法，所用的培養基原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、 牛肉膏、維生素，無機鹽和水配制成液體培養基，從試管斜面菌種上刮取菌苔再轉種在液體 培養基中，經好氧或厭氧培養而制備成液體菌劑，其缺點是:所用原料成本高，生產工藝復 雜，不能節約能源。
[0004] 混合菌劑傳統做法，是將各種不同的菌種(好氧和厭氧)在各自不同的培養基中培 養菌種，然后再從每個菌種的培養物中刮取菌苔制取各個菌的液體菌懸液，再轉種于各自 的液體培養液經通氣或厭氧發酵培養后離心制取活性細胞菌沉淀物，將各自沉淀物經噴霧 干燥制成粉劑，按不同比例制成不同菌的組合混合劑。其缺點是：制備工藝復雜，發酵周期 長，成本高，應用受到限制。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于避免現有微生物液體菌劑生產技術不足之處而提供一種酵母 融合菌混菌劑。它包括有酵母融合菌、地衣芽孢桿菌、圓褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳桿菌液 體菌劑。
[0006] 本發明的又一目的在于提供一種酵母融合菌混菌液體菌劑的制備方法。使用酵母 融合菌、地衣芽孢桿菌、圓褐固氮菌根霉菌和嗜酸乳桿菌配伍，以新鮮豆腐或粉絲或玉米或 馬鈴薯淀粉產生的廢水為原料，添加少量的紅糖無機鹽經發酵制備酵母融合菌、地衣芽孢 桿菌、圓褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳桿菌的液體菌劑。
[0007] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:一種酵母融合菌混菌劑，其特征在于 包括有酉孝母融合菌（Fusant between Candida tropicalisand Saccharmycescevisiae) F105，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為:北京市朝 陽區北辰西路號院3號中國科學院微生物研究所，保藏時間為2014年12月30日，保藏編號為 CGMCC N0.10263;地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)B-36購自中國農業微生物菌種 保藏中心編號為六(：(^11080;圓褐固氣菌(六2〇1：(^&(^61'(3]11'〇〇(3〇(311111)11^-09，保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為:北京市朝陽區北辰西路號院3 號中國科學院微生物研究所，保藏時間為2010年4月26日，保藏編號為CGMCC N0.3768;根霉 菌(他丨20卩118)1?和嗜酸乳桿菌(1^〇1：(^&〇；[1^118-&(^(10卩11；[111111)1^兩菌種均為市場公開銷售菌 種，其中所述酵母融合菌的活菌數為總活菌數的25-40%，地衣芽孢桿菌的活菌數為總活菌 數的15-30%，圓褐固氮菌的活菌數為總活菌數的15-30%，根霉菌的活菌數為總活菌數的 15-30%，嗜酸乳桿菌的活菌數為總活菌數的15-35%。
[0008] 所述的酵母融合菌混菌劑，還包括有發酵淀粉廢水為玉米、豆類、小麥、大麥、薯類 農產品加工生產淀粉時所產生的廢水或豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或馬鈴薯淀 粉廢水，廢水有機物C0D CT為10000-50000mg/L。
[0009] 所述的酵母融合菌混菌劑，所述的酵母融合菌的制備有如下步驟:將酒精酵母菌 作母種的斜面菌轉種和培養，在液體振蕩培養14小時后，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使 用1 %的纖維素酶和1 %蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2小時，溫度33°C，得到酒精酵母原生 質體;將熱帶假絲酵母菌作母種的斜面菌轉種和培養，在液體振蕩培養14小時后，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1.5%的纖維素酶和0.5%蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2.5小 時，溫度33°C，得到熱帶假絲酵母原生質體;將熱帶假絲酵母原生質體經0.1 %碘乙酸滅活， 與酒精酵母原生質體以1:1混合，將沉淀懸于35%聚乙二醇的促溶劑中，30°C水浴靜止處 理，pH6.0，時間為40min，融合菌液經高滲磷酸緩沖液反復沖洗，涂布于高滲基礎培養基和 高滲完全培養基平板培養基上，經30°C、7天培養，平板生長出酵母融合菌。
[0010] 所述的酵母融合菌混菌劑，所述的圓褐固氮菌的制備有如下步驟：
[0011] (1)采樣：圓褐固氮菌是從蘭州市南北兩區地區的暗灰鈣土，淡灰鈣土，紅泥土和 堿土的四種不同土壤類型和多個植物根區的CKlOcm、10-20cm、20-30cm 土壤深度的266份土 樣；
[0012] (2)分離培養:取10g新鮮土樣加入盛有100ml無菌水的500ml三角燒瓶中，放搖床 上振蕩l〇min使土樣均勾地分散在稀釋液中成為土壤懸液，吸取lml上清液加到9ml無菌水 中，按10倍法依次稀釋至1〇_ 4-1〇_6,各重復四次;在已滅菌的培養皿中傾注15-20ml阿須貝 (Ashby)的固體瓊脂培養基，待凝固后用移液槍吸取100ul 土壤稀釋液加到培養基表面，然 后立即用涂布棒將稀釋液涂抹均勻；用相同的方法將樣本不同稀釋度的稀釋液從高稀釋度 到低稀釋度依法涂抹;將接種稀釋的培養皿倒置放在28-32°C恒溫培養箱內培養2-3d后取 出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圓褐固氮菌菌落，轉種在阿須貝瓊脂斜 面試管培養基上，經28-32°C恒溫培養2-3d，取出后即為圓褐固氮菌母鐘，保存在4-8°C冰箱 內備用；
[0013] (3)誘變：將母種再經紫外線（30s)，亞硝基胍(NTG)誘變處理以及生化形態學鑒 定，最后鑒定獲得的菌種轉種于阿須貝瓊脂斜面試管培養基上，即得保藏菌種。
[0014] -種酵母融合菌混菌液體菌劑的制備方法，其主要特點在于有如下步驟：
[0015] A.瓊脂斜面培養基的制備及菌種的培養：
[0016] a.酵母融合菌酵母膏瓊脂斜面培養基的制備：
[0017] 酵母膏0.5-2 %、葡萄糖0.5-2 %、蛋白胨0.2-0.6 %、瓊脂粉1-3 %、無菌水80-120ml，加熱溶解后用1 %的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌， 然后在無菌條件下分裝于15*1.5cm的干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；
[0018] b.地衣芽孢桿菌營養牛肉膏瓊脂斜面培養基的制備：
[0019] 蛋白胨含量重量百分比為0.25-1 %，氯化鈉的含量重量百分比為0.25-1 %，牛肉 膏的含量重量百分比為0.2-0.5%，瓊脂粉的含量重量百分比為1-3%，其余為無菌水，該培 養基的PH為6.5-7.5;
[0020] c.圓褐固氮菌阿須貝(Ashby)瓊脂斜面培養基的制備：
[0021] 甘露醇的含量重量百分比為0.8-1.2%，碳酸|丐的含量重量百分比為0.2-0.8%， 磷酸二氫鉀的含量重量百分比為0.01-0.03%，硫酸鎂(含七個結晶水）的含量重量百分比 為0.01-0.03%，氯化鈉的含量重量百分比為0.01-0.03 %，硫酸鈣(含兩個結晶水）的含量 重量百分比為0.005-0.015%，瓊脂粉的含量重量百分比為1-3%，其余為無菌水，所述培養 基的 PH 為 6.8-7.0;
[0022] d.根霉菌馬鈴薯-蔗糖(PDA)瓊脂斜面培養基的制備：
[0023] 馬鈴薯的含量重量百分比為15-25%，蔗糖的含量重量百分比為1.5-2.5%，瓊脂 粉的含量重量百分比為1-3%，其余為無菌水，所述培養基的PH為5.5-6.5;