一種用于防治煙蚜的擬青霉屬菌株的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物防治技術領域，具體涉及一種用于防治煙蚜的擬青霉屬菌株。
【背景技術】
[0002]隨著人們對自身健康和生存環境關注程度的日益增強，傳統的害蟲化學防治措施所帶來的弊端，已經引起人們的極大重視。化學農藥泛濫使用導致環境中農藥殘留的增加，病蟲抗藥性的增強和病蟲的再度猖獗等問題最為突出。隨著世界各國對化學農藥所帶來的種種社會問題、環境問題、以及人類健康問題的進一步認識，越來越多的化學農藥被限制使用或禁止使用。生物農藥作為一種低毒、低殘留，并且病蟲害不易產生抗藥性的新型農藥，自然就成為現代農藥產業關注并試圖開發的熱點，其研發和產業化也成為國家的戰略需求。
[0003]微生物農藥是生物農藥的重要一類，包括農用抗生素和活體微生物農藥。微生物農藥是從天然產物中分離純化出來的，可以直接作用于病蟲害防治，也可以作為先導化合物合成新的農藥。這些農藥既可以保留原有生物活性物質的低毒、低殘留等優點，同時克服了某些天然產物的穩定性差、活性不高等不足，使得生物活性物質的潛力得到充分挖掘。
[0004]真菌是開發微生物農藥的重要資源，世界各國投入了大量的科研力量予以研究。目前已經注冊的以陸生真菌或其代謝產物為有效成分的生物農藥達70余種，這些微生物農藥被廣泛應用于防治植物病害、蟲害和田間雜草。我國在應用和基礎研究方面也取得了十分突出的成績。盡管我國當前生物農藥的產量僅占農藥總產量的9%，但從人類長遠利益角度考慮和農藥發展趨勢來看，生物農藥的發展潛力十分巨大。海洋真菌來源于海洋環境，并不是陸地生物的寄生菌，在直接以微生物活體作為有效殺蟲劑或殺菌成分的生物農藥開發模式面前，海洋真菌于陸地真菌相比，沒有優勢可言，但在以微生物代謝為有效成分的農藥開發模式下，海洋真菌卻具有很大優勢。
[0005]海洋真菌的生存環境比較苛刻(高鹽、高壓、缺氧、低營養、無光照等)，為求得生存空間，它們在長期的進化過程中產生了一些結構獨特的次生代謝物質，特別是海洋動植物共附生真菌，為爭取自身的最大生存，通過分泌具有各種生物活性的代謝物來積極地參與動植物的代謝活動，在動植物的抗感染、抗吞噬的生態防衛中發揮了重要的作用，被認為是篩選抗生素的最佳對象。從海洋真菌中分離得到的新化合物70%_80%具有各種各樣的生物活性，也已引起化學家和生物學家的極大關注，種類包括萜類、肽類、生物堿、酮類以及酯類化合物，其中有很多是某些殺蟲劑、殺菌劑的有效成分或前體物質。關于海洋真菌次生代謝物的功能與用途，研究者較多的關注于治療人類疾病的醫用藥物的開發，海洋真菌代謝物農用殺蟲、殺菌功能的研究較少。
[0006]煙蚊Myzus persicae(Sulzer)屬同翅目蚊科，是重要的農業害蟲之一，可為害煙草、十字花科蔬菜、桃樹等多種植物，同時也是黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種植物病毒的傳播媒介。目前，煙蚜的防治最有效的方法仍是化學防治，同時也有諸多有關生物防治方法的成功應用(例如天敵煙蚜繭蜂的繁殖和釋放等)，但對于利用海洋微生物次生代謝物來探索開發煙蚜生物制劑還未見報道。因此本試驗將從生物防治方面進行探索，篩選對煙蚜有毒殺活性的海洋真菌菌株，為將來利用這些菌株及其次生代謝產物開發生物制劑防治煙蚜提供研究基礎和實驗材料。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一株用于防治煙蚜的菌株，即一株來自海洋底泥的擬青霉屬(Paecl1myces.sp)菌種及其在煙蚜生物防治中的應用，同時將篩選的可產生對煙蚜有生物活性次生代謝物的菌株應用到煙蚜的生物防治中，從而彌補現有技術的不足。
[0008]本發明的擬青霉(Paecl1myces.sp)mfn21菌株，已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為:CGMCC N0.11659。
[0009]本發明篩選的mfn21菌株的生長溫度范圍為25?30°C，最佳生長溫度為28°C;最適pH值為10.0;使用的培養基為PDA海水培養基。
[0010]本發明篩選的mfn21菌株用于防治煙蚜，也可用來制備具有防治煙蚜功能的制品。
[0011]本發明的mfn21菌株的代謝產物，其制備方法如下:
[0012]1)首先將mfn21菌株進行擴大培養，然后將培養液中培養基去掉，獲得的菌體中加入乙酸乙酯進行萃取;將萃取液旋轉蒸發后制成浸膏；
[0013]2)取D101大孔吸附樹脂，先用去離子水洗凈，再用無水乙醇洗至液體不渾濁;將處理后的D101大孔吸附樹脂上柱后，用氫氧化鈉洗至中性，再用鹽酸洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性后，將步驟1)制備的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去離子水混合，用大孔吸附樹脂靜態吸附24h，然后用無水乙醇梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮獲得mfn21菌株的代謝產物。
[0014]上述的代謝產物用于防治煙蚜。
[0015]本發明獲得的對煙蚜有生物活性的mfn21菌株，可應用于煙草上煙蚜的防治，采用微量點滴法對煙蚜的生物測定表明，其發酵液中次生代謝物對煙蚜的致死率最高可達97.78%。采用GC/MS進行化學分析和結構鑒定后，次生代謝物包括有7種主要化合物，其中生物堿類化合物2種，酯類化合物2種、糖苷類化合物，肽類化合物、醇類化合物各1種。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明的菌株進行詳細的描述。
[0017]一、擬青霉屬Paecl1myces.sp mfn21 菌株的篩選
[0018]無菌條件下，用已酒精滅菌的注射頭將底泥樣品10g從采樣玻璃管中取出，加入盛有100mL滅菌海水的三角瓶中，置恒溫振蕩器上，150rpm振蕩20min，使沉積物顆粒均勻分散。將制備好的沉積物懸液靜置5min，吸取200yL上清液涂布平板，放置在常溫條件下培養，從形成的菌落的邊緣挑取菌絲體移植到PDA平板上，純化后獲得該菌株。經18s rDNA ITS基因序列分析鑒定為枝頂孢屬(Acremonium sp.)。經18s rDNA ITS基因序列分析鑒定為擬青霉屬屬(Paecl1myces.sp)。
[0019]二、mfn21菌株的形態、理化參數
[0020]l、mfn21菌株的形態特征
[0021]顯微鏡下觀察，mfn21菌絲透明，分隔，表面光滑。分生孢子梗散生或聚集成簇，多由輪狀或不規則的瓶梗狀分枝組成，其頂部著生產孢瓶體，產孢瓶梗也可單生于營養菌絲上。瓶梗由柱狀或膨大的基部和變細的頸部組成;分生孢子常形成鏈或單生，無隔膜，壁光滑，透明，橢球形至球形，直徑3.4-4.6μηι。無厚垣孢子。
[0022]2、培養條件
[0023]mfn21菌株在TOA平板上培養后，菌落稍突起，紫色至淡褐色。25°C