植物乳桿菌固定化制劑的制作方法
【技術領域】：
[0001 ]本發明屬于微生物菌劑領域。
【背景技術】：
[0002] 乳酸菌是對一類能利用可發酵糖類產生大量乳酸的細菌的通稱。在分類學上屬于 非正式、非規范的慣用名稱，但因為它很容易被人們所理解和接受而廣泛引用。乳酸菌是正 常人體腸道中極為重要的生理菌群之一，它具有維持人體微生態平衡、促進消化、防癌抗 癌、增強免疫力、抗衰老等作用，與機體健康息息相關。近年來，乳酸菌作為一種有益菌得到 了廣泛的研究和開發，目前已廣泛應用于保健食品、醫藥和食品等行業中 [1]。但是乳酸菌較 難長期保存，因此，乳酸菌的保藏成了熱門的研究課題。利用真空冷凍干燥技術生產活菌制 劑是多種保藏方法中較為理想的一種 [2]。而制作菌粉的關鍵是保護劑種類及配比的選擇。 因此，選擇一種使用便捷的保藏形式，以及研究使菌種存活率高的保護劑配方有著積極意 義。
[0003] 乳酸菌容易退化、失活，如何解決乳酸菌的保藏是生產中面臨的首要問題。目前， 日本把培養的乳酸菌制成懸浮液密封在包裝材料里(包裝材料可用合成樹脂薄膜制或用鋁 箱制），其裝量可根據具體情況而定。封好的乳酸菌懸液，一定要保存在30°C以下，最好在Ο-? 〇°C 保存。
[0004] 乳酸菌的長期保藏方法，多采用冷凍干燥法或噴霧干燥法，將乳酸菌制成粉劑，用 以延長保存時間。冷凍干燥是將欲保藏的微生物細胞懸浮液凍結后，在真空條件下使冰升 華，最后達到干燥的目的。此方法主要是根據微生物生理、生化特點，干燥后使微生物的代 謝處于不活潑、生長繁殖受到抑制，達到休眠狀態，以保持菌株原有特性。而且用這種方法 生產的發酵劑與噴霧干燥法等其他方法生產的發酵劑相比具有更高的穩定性、活性。
[0005] 但真空冷凍干燥過程是使發酵液中的游離水在凍結狀態下失去的一個過程，冷凍 和干燥兩個過程會造成部分微生物細胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化 [8]，如果凍 干工藝中保護劑選擇不當，就會使乳酸菌的存活率下降。發酵液干燥前后乳酸菌的存活率 大小可直接體現不同保護劑對乳酸菌活力的影響。因此，凍干保護劑是制作干燥發酵劑最 為關鍵的因素之一，它不僅影響發酵劑在凍干過程中的細胞存活率，也影響保藏期間的細 胞穩定性。
[0006] 如今對于微生物菌粉保護劑的研究日益深入，駱承庫、劉振民等[9]研究發現乳酸 菌經過凍融處理后，致死率增加。引起致死損傷的主要因素是機械效應、溶質效應和干燥效 應。在冷凍保存菌種時加入保護劑或采取適宜的凍藏、凍干條件，可以減輕菌體的生理性或 致死性損傷。保護劑明顯提高菌體存活率的原因是由于：
[0007] ①保護劑存在的氫鍵和/或離子基團具有與細胞蛋白質結合的能力，這種結合起 到穩定細胞蛋白結構的作用，從而保護菌體，避免損傷。不同保護劑結合能力不同，所形成 的網絡結構緊密程度就不一樣。
[0008] ②保護劑的持水性和形成的網絡，使得干燥過程中細胞的水分不至于急劇下降， 而使細胞蛋白質結構遭到破壞，菌體受損。網絡結構越緊密，干劑殘存水分含量越高。
[0009] ③網絡結構還使較多的菌體被包裹其中，從而減少菌體與氧氣接觸的機會，得到 較好的保護。而纖維結構表面積大，包裹的菌相對較少，大量的菌體暴露于表面，受損嚴重。
[0010] 保護劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學環境，進而減輕或防止冷凍干 燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性。保護劑按作用 方式可分為能透入細胞的保護劑和不能透入細胞的保護劑2種，按分子大小分為低分子化 合物(如低聚糖類、醇類、緩沖鹽類、氨基酸和維生素類） [1<)]和高分子化合物(如蛋白質、多 肽和多糖類)[11]。曹永梅[12]等對大分子保護劑對乳酸菌的保護作用進行了研究，他們認為 以脫脂奶粉與蔗糖、甘油復配后的保護效果最佳。這是因為三者具有互補作用，脫脂奶粉主 要在細胞表面起保護層作用，甘油能滲透到細胞內部。呂為群等 [13]提出作為低分子保護劑 應具有較強親水性，結構上應具備3個以上氫鍵，對糖、醇而言應有5個以上羥基，可與菌體 細胞膜的磷脂中的磷酸基團或與菌體蛋白質極性基團形成氫鍵 [14]，從而保持菌體結構與 功能的完整。而大分子保護劑主要是通過包裹菌體而起到保護作用，且能對低分子保護劑 有促進作用 [11>14]，可兩者協同使用效果更佳。
[0011]隨著20世70年代興起的固定化微生物細胞技術的發展，為細胞濃縮和發酵劑保藏 開辟了新的途徑。人們發現固定化的微生物細胞因受固定化材料的保護而提高了微生物對 環境的適應性。把細胞固定在某種載體上，可提高細胞的穩定性、抗污染能力，并縮短細胞 的延遲期。細胞的固定化材料很多，如蛋白質、多糖、聚乙烯醇等無毒性的聚合物，其能夠形 成凝膠狀結構。
【發明內容】
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[0012]本發明提供一種植物乳桿菌固定化制劑及其制備方法。
[0013]技術方案如下：
[0014]植物乳桿菌固定化制劑由如下方法制得植物乳桿菌液體培養到對數期中后期時 停止發酵離心收集菌體備用。
[0015]冷凍干燥保護劑以10%脫脂乳為懸浮基質，添加2-5%小分子聚谷氨酸(20萬Da)、 1-2 %大分子普魯蘭多糖、5-12 %麥精，混合冷凍干燥保護劑溶液稀釋菌體，將懸浮液中菌 體濃度調節為101()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預凍4小時后，置于真空度為1 .Opa 的冷凍干燥器凍干24小時制得菌粉。
[0016] 植物乳桿菌為CGMCC NO. 11763,所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)于 2015年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，保 藏號為，保藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵 編：100101 〇
[0017] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0018] 本發明所提供的植物乳桿菌CGMCC N0.11763經實驗發現能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1%膽鹽培養4小時后仍處于存活狀態;植物乳桿菌CGMCC N0.11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達到10.9mg/h/kg，該菌種在生產泡菜時，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在發酵60h小時后，對膽固醇降解率可達到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力測定的自凝集率為95 · 71 %。
[0019] CGMCC NO. 11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0020] 取lml CGMCC N0.11763母液接種于10mL的MRS膽固醇液體培養基（膽固醇含量 0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養20h、40h、60h備用，以接入lmL無菌水的MRS 膽固醇培養基為對照，取以上培養不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發酵上清液，鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . lml于相應的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.0ml，混合均勻。室溫靜置lOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復，以同樣方法制 作膽固醇標準曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結果見表1。可知，CGMCCN0.11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發酵60h小時后，降解率可達到64.76%。
[0021] 表1對膽固醇的降解情況
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[0023] 菌CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0024] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%