一種針對pitpnm3的單克隆抗體及其用圖
【技術領域】
[00011本發明屬于單克隆抗體領域，涉及針對CCL18 (趨化因子配體18)功能受體PITP匪3 的單克隆抗體，以及該單克隆抗體的用途。
【背景技術】
[0002] 巨噬細胞是腫瘤微環境中最為重要的免疫細胞，巨噬細胞在不同的環境條件下會 表現出不同的表型從而對腫瘤表現出截然不同的作用。而腫瘤相關巨噬細胞是由巨噬細胞 在腫瘤微環境中誘導產生的。腫瘤相關巨噬細胞能促進腫瘤的迀移、轉移和進展。而在針對 腫瘤的治療方案中，抗體靶向性治療已逐漸發展成為惡性腫瘤治療的重要組成部分。單克 隆抗體作為特異強、靶向性好的藥物在臨床上具有非常高的應用價值和意義。然而單克隆 抗體在臨床治療應用中的研究和進展卻是相對滯后，因此有必要開發針對腫瘤微環境作用 的單克隆抗體。
[0003] 在前期研究中，發明人從人乳腺癌標本分離出腫瘤相關巨噬細胞，通過分析其細 胞因子表達譜，發現CCL18(趨化因子配體18)是乳腺癌腫瘤相關巨噬細胞分泌最多的細胞 因子。體內外實驗證實，CCL18除了直接促進腫瘤細胞與細胞外基質的粘附，誘導腫瘤細胞 發生上皮間質轉化，從而促進腫瘤細胞轉移，還誘導血管形成、募集幼稚T淋巴細胞將其誘 導為免疫抑制Treg、誘導正常成纖維細胞分化為促腫瘤表型(Chen J*，Yao Y*，Gong C*，Yu F*,Sun S，Chen J,Liu B,Deng H,Wang F,Lin L，Yao H,Sun F,Karen S.Anderson,Liu Q, Mark E.Ewen,Yao X#, Song E#.CCL18from Tumor-Associated Macrophages Promotes Breast Cancer Metastasis via PITPNM3.Cancer Cell.2011,19(4):541-555.)。
[0004] 發明人通過與CCL18免疫共沉淀和質譜分析鎖定腫瘤細胞膜蛋白PITP匪3。CCL18 和PITPNM3特異性結合在乳腺癌細胞的細胞膜表面。接著，發明人發現在乳腺癌細胞和幼稚 淋巴細胞中敲低PITP匪3能抑制CCL18介導的信號通路激活和趨化運動。最后，發明人在穩 定轉染PITP匪3的HEK293細胞中通過多種公認鑒定細胞因子受體的方法證明PITP匪3是 CCL18的功能受體。因此，有必要開發針對PITPNM3的單克隆抗體，可能為腫瘤細胞和間質細 胞的靶向治療提供新思路。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種針對PITPNM3的單克隆抗體，它能在體內外模型中明顯抑制腫瘤 相關巨噬細胞誘導乳腺癌細胞的轉移。
[0006] 本發明所述的一種單克隆抗體，能特異性地識別趨化因子配體18功能受體 PITP匪3，是由保藏號為CCTCC NO:C2014190的PITPNM3mAb雜交瘤細胞株所分泌的。該雜交 瘤細胞株保藏單位為中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址是中國湖北省武漢市武漢大 學，保藏日期為2014年10月22日。
[0007] 本發明還提供了所述的針對PITPNM3的單克隆抗體的用途。
[0008] 本發明所述的用途是將所述的單克隆抗體用于制備抑制腫瘤相關巨噬細胞誘導 乳腺癌細胞轉移的藥物的用途。
[0009]發明人通過專業軟件分析挑選出16個抗原表位，然后針對這16個抗原表位研制出 16個針對不同抗原表位的PITPNM3單克隆抗體。經過反復篩選驗證，發明人發現其中一個針 對PITPNM3胞外段的單克隆抗體，在共培養體系中加入PITPNM3單克隆抗體能明顯抑制腫瘤 相關巨噬細胞誘導腫瘤細胞的EMT、迀移和侵襲。在進一步的體內試驗中，發明人驗證了 PITPNM3單克隆抗體的藥效，通過建立人源化小鼠技術（1 .Shicheng Su，Qiang Liu，Jingqi Chen,Jianing Chen,Fei Chen,Chonghua He,Di Huang,Wei ffu,Ling Lin,Wei Huang,Jin Zhang,Xiuying Cui,Fang Zheng,Haiyan Li ,Herui Yao,Fengxi Su,Erwei Song . A positive feedback loop between mesenchymal-like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis.Cancer Cell .2014,25,1-16.)的巨細胞 促進腫瘤細胞的肝肺轉移模型，即注射PITPNM3單克隆抗體后，發現其能明顯抑制巨噬細胞 促進腫瘤細胞的肝肺轉移及延長荷瘤小鼠的生存期。
【附圖說明】
[0010] 圖1顯示體外插入孔實驗檢測PITP匪3單克隆抗體抑制乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231 迀移的結果。
[0011]圖2顯示細胞迀移計數結果，發現有三個抗體有較為明顯中和功能，其中一個抗體 中和效果達到約70% (箭頭所指）。
[0012]圖3顯示PITPNM3單克隆抗體能抑制腫瘤相關巨細胞分泌的CCL18所引起的乳腺 腫瘤細胞的上皮間質轉化。上排為相差顯微鏡。圖中，下排為DAPI(藍色），E-cadherin(紅 色），vimentin(綠色）的免疫焚光。
[0013]圖4顯示PITPNM3單克隆抗體能抑制腫瘤相關巨噬細胞分泌的CCL18所引起的乳腺 腫瘤細胞的侵襲與迀移。
[0014]圖5顯示PITPNM3單克隆抗體對腫瘤細胞的迀移能力和侵襲能力的影響。
[0015 ] 圖6顯示PITPNM3單克隆抗體抑制小鼠肝肺轉移情況。
[0016]圖7顯示PITPNM3單克隆抗體能延長荷瘤小鼠生存期情況。
【具體實施方式】
[0017] 實施例一:針對PITPNM3的單克隆抗體的制備
[0018] 發明人所在的研究團隊利用上海Abmar t公司獨有的SEAL抗原設計技術對PITPW3 氨基酸全序列進行分析，并進行綜合評分，挑選16個10肽作為抗原(表一）。
[0019] 表一:從PITPNM3氨基酸序列得到的16個抗原序列及其起止氨基酸殘基位置
[0020]
[0022]通過化學合成的方法合成上述1 6條1 0肽抗原的核苷酸序列并連上T載體 (TAKARA)，并在抗性瓊脂平板上進行藍白斑篩選挑選陽性克隆，經菌落PCR鑒定并測序驗證 后將該陽性克隆小轉入小規模培養后抽提質粒進行雙酶切，將目標片段進行切膠回收并連 上真核表達載體pcDNA3.1(購買自Invitrogen)，轉化大腸桿菌(E.coli)后擴增表達質粒， 中量抽提表達質粒，經純化后轉染HEK293細胞（購買自美國ATCC)。大規模培養并收集 HEK293細胞，經靜脈注射注入小鼠外周血中，經過初次基礎免疫及加強免疫后，殺死小鼠并 獲取小鼠脾臟，碾碎制成單細胞懸液，過濾并離心祛除雜質后收集較純的脾細胞，加入完全 培養基進行培養。
[0023]培養骨髓瘤細胞株SP2/0(購自美國典型生物保藏中心ATCC，http : // WWW. atcc. org/products/al l/CRL-8287. aspx)，并維持其最佳生長狀態，使其在細胞融合 時處于對數生長期。將脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合，根據常規方法制成雜交瘤細胞 株。
[0024]大規模培養雜交瘤細胞株，通過有限稀釋法對雜交瘤細胞株進行克隆化，從而獲 取穩定分泌抗體的純系雜交瘤細胞株。將常規培養的雜交瘤細胞用胰酶消化并計數，將雜 交瘤細胞稀釋后的懸液種入96孔板中進行培養，稀釋倍數按照每孔中僅有1個細胞為標準， 經過連續多天培養后，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體;在倒置顯微鏡下觀察，標出只有 單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。將上清中檢測出抗體效價較高的孔做好標記，將該 孔中細胞進行規模培養，重復進行上述有限稀釋法進行克隆化篩選，重復篩選2-3輪次，從 而保證產生單克隆抗